论文部分内容阅读
第一部分：微管和微丝在人卵母细胞体外成熟中的作用探讨[目的]卵母细胞的成熟过程中,细胞质中的细胞器会发生一系列的变化以保证减数分裂的正常进行,细胞骨架尤其是微管和微丝在这些变化中起到了重要的作用。本课题主要研究人卵母细胞成熟过程中,纺锤体形成和排列、染色体排列和定位的变化规律,以及皮质颗粒(cortical granule, CG)和线粒体在这一过程中分布变化的规律；并探讨微管和微丝系统在这些变化过程中的作用。[方法]人生发泡(germinal vesical, GV)期卵母细胞来源于2007年12月至2008年11月就诊于山东大学附属省立医院生殖医学中心,因单纯男方因素或同时合并女方输卵管因素行卵母细胞内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)的不孕症患者。促排卵过程在获得大量成熟卵母细胞的同时,也产生部分未成熟的GV期卵母细胞,将这部分卵母细胞随机分组,对照组在成熟培养液中培养24-48h,实验组分别在含有10μM微管聚合抑制物-colchicine或微丝聚合抑制物-cytochalasin B(CB)的成熟培养液中培养24-48h。将卵母细胞固定后行免疫荧光染色,通过激光共聚焦显微镜观察纺锤体形成和迁移的情况,染色质形态和位置,CG和线粒体的分布情况,探讨微管和微丝在这些变化中的作用。[结果]对照组：68.42%(52／76)的卵母细胞可成熟至第二次减数分裂中期(metaphaseⅡ, MⅡ),纺锤体位于皮质区,染色体聚集并排列在赤道板上；大部分人GV期卵母细胞中,CG均匀分布于胞质中,体外成熟以后,73.53%(25／34)的卵母细胞中,CG向胞膜下迁移,呈线性分布；64.10%(50／78)的GV期卵母细胞中,线粒体呈周边分布,体外成熟至MII期后,75.47%(80／106)的卵母细胞中,线粒体呈均匀分布。colchicine组：生发泡破裂(germinal vesical breakdown, GVBD)能够发生,但大部分卵母细胞成熟进程阻滞在第一次减数分裂中期(metaphase I,MI)；染色体聚集,并能够迁移至皮质区,但纺锤体不能形成；在76.67%(23／30)的停滞于MI期的卵母细胞中,CG可迁移至胞膜下,呈线性分布；IVM48h后,47.06%(24／51)的卵母细胞中,线粒体仍维持周边分布,未能向胞质中央迁移,仅有37.25%(19／51)的卵母细胞中线粒体呈均匀分布。CB组：GVBD能够发生,但83.33%(80／96)卵母细胞成熟进程阻滞在MI期；染色体凝集,纺锤体能够形成,但不能迁移至皮质区,而是分布于胞浆中央；83.87%(26／31)的卵母细胞中,CG保持均匀分布,未能向胞膜下迁移；71.70%(38／53)的卵母细胞中,线粒体呈均匀分布。[结论](1)人卵母细胞成熟过程中,染色体的聚集与微管和微丝均无关,但纺锤体和染色体向皮质区的迁移是由微丝介导的；(2)人卵母细胞成熟过程中CG向皮质区迁移是由微丝介导的；(3)人卵母细胞成熟过程中线粒体向胞质中央迁移是由微管介导的。第二部分：未成熟人卵母细胞与卵丘颗粒细胞单层共培养的临床应用[目的]未成熟卵母细胞体外成熟培养(in vitro maturation, IVM)因其独特的优势而受到了广泛关注,成为生殖医学的研究热点。但其与常规体外受精(in vitro fertilization, IVF)/ICSI相比,仍然存在成熟率、受精率、卵裂率及优胚率偏低,多精受精率高,临床妊娠率及胚胎着床率较低等问题。原因之一就是受体外培养条件所限,细胞质的成熟不充分或者核质成熟不同步。既往研究认为卵母细胞IVM过程中与颗粒细胞单层共培养可促进卵母细胞的成熟,提高其发育潜能。本中心的前期研究也证实,共培养可促进人卵母细胞的胞质成熟。在此基础上,本研究对与颗粒细胞单层共培养后成熟的卵母细胞进行体外受精,观察了其受精率、卵裂率,并挑选胚胎进行移植,随访妊娠结局,统计了临床妊娠率以及胚胎种植率,与对照周期比较,以此来评价单层颗粒细胞共培养对人卵母细胞体外成熟和胚胎发育潜能的影响,探讨其常规应用于IVM临床的必要性和可行性。[方法]2007年11月-2008年10月就诊于山东大学附属省立医院生殖医学中心的PCOS不孕患者25人,因同时合并女方输卵管因素或男方因素行IVM／ICSI-ET,未成熟卵母细胞与卵丘颗粒细胞单层体外成熟共培养(共培养周期)。对照组70人在94个周期(对照周期)中采用普通IVM培养液培养,IVM28-30h后行体外受精。比较两组的卵母细胞成熟率、受精率、卵裂率、胚胎移植后的临床妊娠率以及胚胎种植率。[结果]共培养周期与对照周期比较,卵母细胞细胞核成熟率及受精率无显著差异(P>0.05)；但共培养周期的卵裂率高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。共培养IVM移植周期20个,共移植胚胎55个,临床妊娠7例(35.00%,7／20)其中1例为双胎,胚胎着床8(14.55%,8／55)个。对照组移植75个周期,妊娠18例(24.00%,18／75),其中16例单胎,2例双胎,胚胎着床率为6.04%(20／331)。共培养周期与对照周期相比,临床妊娠率无明显差异,但胚胎种植率显著提高(P<0.05)。[结论]未成熟人卵母细胞与卵丘颗粒细胞单层共培养可提高卵裂率,提高胚胎的发育潜能,进而提高胚胎种植率。在IVM临床中常规应用卵丘颗粒细胞单层共培养是有利和可行的。