论文部分内容阅读
细胞程序性死亡(programmedcelldeath,PCD)是在多细胞生物体中广泛存在的现象。细胞程序性死亡的起始和完成都受严格的调控,在多细胞生物生长发育以及逆境耐受等多个过程中都发挥了重要作用。在高等植物中,最为系统深入研究的细胞程序性死亡过程是在应对病原菌侵染时出现的超敏反应(hypersensitiveresponse,HR)。超敏反应的发生会在病原菌侵染的部位出现细胞死亡,这种快速的细胞死亡会限制病原菌向植物的其它部位扩散,并且该过程还会伴随产生各种信号分子,例如活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)、水杨酸(salicylicacid,SA)和活性氮(reactivenitrogenoxideintermediates,NOI)等,从而激活植物的系统抗性。其中细胞间质中的ROS主要是由定位于细胞膜上的NADPH氧化酶产生的,而其它细胞器例如叶绿体、线粒体和过氧化物酶体产生ROS的量也会增加。当植物体内ROS的量积累到一定水平时,将被ROS清除酶(ROSscavengerenzymes)分解,以保持体内ROS的相对平衡。在这个过程中,SOD(superoxidedismutase)将超氧阴离子自由基(O2(·)-)转化为过氧化氢(H2O2)后,抗坏血酸过氧化物酶(ascorbateperoxidase,APX)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase,GPX)和过氧化氢酶(catalase,CAT)等可以将H2O2催化生成H2O和O2。其中过氧化氢酶的特点是其与H2O2的亲和力较低,但因为其催化的反应不消耗还原力且与底物H2O2有很快的反应速率,所以在体内H2O2浓度很高时发挥重要作用。 植物超敏反应过程会出现一些可见病斑。利用这一现象,研究者们分离鉴定了许多类病斑突变体(lesionmimicmutants,LMM)。植物类病斑突变体在没有病原菌侵染与明显的逆境损害时就会自发的形成一些坏死斑。其中拟南芥lsd1(lesionsimulatingdisease(1))突变体是一个重要的类病斑突变体。前人的研究发现LSD1是拟南芥中控制细胞程序性死亡的一个负调控因子。lsd1突变体在长光照下生长就会自发的出现叶片坏死表型,即蔓延型细胞死亡(runawaycelldeath,RCD)。RCD的产生主要是由于ROS的不正常积累以及ROS相应的清除体系不能正常运行造成的,且依赖于SA的积累。LSD1蛋白含有三个新型的锌指结构,被称为类LSD1锌指结构。该锌指结构在LSD1与其它蛋白互作过程中发挥重要作用。由于LSD1基因在调控植物细胞程序性死亡与胁迫反应中具有重要作用,因此对其功能进行了广泛的探索。但是目前对LSD1基因调控植物细胞程序性死亡的分子机理,特别是其生化功能不甚了解。 为了深入研究LSD1调控植物细胞程序性死亡的分子机理,在本研究中,我们筛选了LSD1的互作蛋白,并对其调控植物细胞程序性死亡的机理进行了研究。通过免疫共沉淀结合质谱分析技术,我们分离鉴定了六个LSD1的互作蛋白。其中一个代表性的互作蛋白是过氧化氢酶CAT3。拟南芥基因组中共有3个高度相似的CAT基因(CAT1,CAT2和CAT3),其编码蛋白的相似性在87-94%之间。其中,CAT3在营养生长期表达量最高,而CAT2代表了主要的酶活。通过酵母双杂交实验以及植物体内的免疫共沉淀实验,我们证明LSD1与三个CAT蛋白在体外、体内均能互作,且LSD1蛋白的锌指结构在其与CAT蛋白的互作中是必需的。生化分析证明lsd1突变体中过氧化氢酶的酶活降低,表明LSD1参与调控过氧化氢酶的活性。与此吻合,lsd1突变体对过氧化氢酶的抑制剂3-氨基-1,2,4-三唑(3-amino-1,2,4-triazole,3-AT)超敏感,暗示LSD1蛋白与CAT蛋白的互作对植物体应对过氧化物酶体产生的ROS有重要的作用。遗传学分析表明lsd1突变体光依赖的蔓延型细胞死亡以及超敏反应过程中的细胞死亡过程都会因为CAT酶活的降低而增强,证明相应细胞死亡过程是受LSD1和CAT蛋白协同调控的。遗传分析同时表明LSD1和CAT蛋白协同调控的细胞死亡过程需要水杨酸的积累。 上述结果证明,拟南芥中的LSD1能够通过与清除H2O2的过氧化氢酶相互作用发挥其负调控植物细胞程序性死亡的功能。LSD1通过其锌指结构与CAT蛋白相互作用并调控CAT的酶活以及相应的过氧化物酶体中的ROS信号,共同调控植物细胞在胁迫条件下的程序性死亡。我们的研究结果为揭示LSD1调控细胞程序性死亡的分子机理、探索ROS参与植物细胞程序性死亡的分子机理提供了新的线索。