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越来越多的实验结果证明了细胞膜磷脂酰肌醇4,5二磷酸(PtdIns (4,5) P2,PIP2)在细胞内信号转导过程中发挥着重要的作用。细胞膜上的PIP2在诸如众多的离子通道及离子转运体功能调节、细胞骨架、囊泡输送、融合,及出胞和入胞等细胞过程中起重要作用。细胞膜PIP2不仅是某些重要信号分子,如二酰甘油(DAG)和三磷酸肌醇(IP3)的前体。PIP2本身作为信号分子发挥着自己的功能,它的水平被动态调节。细胞膜PIP2水平的一个重要的调节机制是磷脂酶C (PLC)介导的PIP2水解,这种事件依赖性调节机制是众多受体调节离子通道功能的重要机制。此外,在细胞中存在对稳态PIP2水平调节的精细机制,主要通过多种肌醇磷脂酰肌酶和磷酸酶来实现。在这项研究中,我们描述了一个细胞膜PIP2代谢调节的新机制。细胞膜电位去极化引起细胞膜PIP2水平增加,进而增加表达于非洲爪蟾卵母细胞中功能依赖PIP2的KCNQ2/Q3电流。进一步的实验证据显示细胞膜去极化引起的PIP2水平提高是通过激活蛋白激酶C (PKC)进而增加PI 4-激酶(PI4 kinase)的活性引起的。一、细胞膜去极化对表达于非洲爪蟾卵母细胞的KCNQ2/Q3通道电流的影响目的:在对KCNQ/M电流的研究过程中,我们发现表达在爪蟾卵母细胞的KCNQ2/Q3的功能对膜电位的变化敏感,而这种反应又有别于通道本身的电压依赖性,本部分实验对此现象进行详细描述,并对其机制进行探讨。方法:将KCNQ和Kir通道的质粒线性化,体外转录成相应的cRNA,注入非洲爪蟾卵母细胞,表达为相应通道,用双电极电压钳记录的方法,观察细胞膜去极化及细胞外液钾离子浓度的改变对KCNQ电流的调节。结果:(1)长时间膜电位去极化(-40 mV ~ +40 mV),可观察到表达于非洲爪蟾卵母细胞中的KCNQ2/Q3电流呈时间依赖性及电压依赖性增加。当膜电压再极化回到静息电位水平时,KCNQ2/Q3电流恢复到原水平,这说明去极化引起的KCNQ2/Q3电流增加具有可逆性特征。用M/KCNQ通道特异阻断剂linopirdine (30μM)可完全阻断初始电流和增加的电流,这说明增加的电流是KCNQ2/Q3电流,而不是其它的电流成分。(2)通过测定电压钳制(0 mV,15 min)前后, KCNQ2/Q3电流在0 mV激活及-60 mV去活的时程,观察到膜电位去极化不改变KCNQ2/Q3电流动力学时程。通过测定膜电位去极化(0 mV, 15 min)前后KCNQ2/Q3电流的电导-电压关系曲线,可观察到膜电位去极化不改变KCNQ2/Q3电流激活特点。(3)在卵母细胞上分别表达不同亚型的KCNQ通道,观察膜电位去极化(0 mV,15 min)对其电流幅度及电流特征的影响,发现去极化对KCNQ电流的调节具有亚型特异性。去极化可增大KCNQ2和KCNQ2/Q3电流,但不影响KCNQ1和KCNQ1/KCNE1电流。去极化对KCNQ2作用的电压依赖性特点与对KCNQ2/Q3影响的特点相同,二者半最大增大电压无明显差异。同样,去极化不改变KCNQ2通道电流的激活特征。(4)在卵母细胞上分别表达Kir2.1和Kir2.3通道,观察膜电位去极化(+40 mV)对二者电流的影响,发现去极化可不同程度地增大Kir电流,去极化增大Kir2.3电流的程度大于Kir2.1。我们以前的研究显示Kir2.1对PIP2亲和力较Kir2.3大,提示去极化可能通过影响PIP2水平调节通道功能。(5)观察了细胞外钾离子浓度对KCNQ2/Q3电流的影响,目的是为了检测去极化引起的KCNQ2/Q3电流增大是否是因为钾离子大量外流引起的细胞外钾浓度升高所致。发现提高细胞外液钾离子浓度(10 mM)不影响去极化对KCNQ2/Q3电流的作用。(6)使用高钾外液(ND96K:含96 mM K+)使膜电位去极化,来模拟电压钳制的效果,观察其是否也可以引起KCNQ2/Q3电流增大。发现ND96K孵育(15 min)引起的电流增加幅度与ND96下电压钳制在0 mV(15 min)无明显差异。高钾同样不影响KCNQ2通道的电流动力学和激活特征。这些结果证明去极化本身可以使KCNQ2/Q2电流增加。结论:(1)膜电位去极化可增大表达于非洲爪蟾卵母细胞中的KCNQ2/Q3通道电流。这种增大作用具有时间依赖性及电压依赖性的特征。(2)膜电位去极化没有影响KCNQ2/Q3通道电流动力学时程及电导-电压关系曲线。(3)膜电位去极化对KCNQ电流的调节具有亚型特异性。(4)膜电位去极化可不同程度增大Kir亚型通道电流。提示去极化可能通过影响PIP2水平调节通道功能。(5)提高细胞外液钾离子浓度(10 mM )不能取消或降低去极化钳制引起的KCNQ2/3电流增大的现象,表明去极化引起的电流增大与细胞外钾浓度的增加无关,即:KCNQ2/3电流增大由膜电位去极化本身引起。(6)细胞外高钾使膜电位去极化并可模拟电压钳制引起的KCNQ2/Q3电流增大,同样不影响通道的激活特性。这进一步证明了膜电位去极化本身可增大KCNQ2/Q3电流。二、细胞膜去极化提高细胞膜PIP2水平进而增大KCNQ2/3通道电流的分子学机制目的:上部分实验提示细胞膜去极化可能通过提高细胞膜PIP2水平,进而增大了表达于非洲爪蟾卵母细胞的KCNQ2/Q3。这部分我们主要研究其分子学机制。方法:(1)将KCNQ2/Q3通道和Ci-VSP共表达于非洲爪蟾卵母细胞,用双电极电压钳记录的方法,观察Ci-VSP和去极化对KCNQ2/Q3电流的调节,探讨去极化过程对PIP2水平的影响。通过使用高渗溶液预提高膜PIP2含量,观察膜电位去极化对PIP2水平的影响。(2)通过使用PI 4-激酶的拮抗剂阻断PIP2的合成,观察PI 4-激酶是否介导了膜电位去极化引起PIP2水平提高的过程。(3)通过使用PKC的激动剂和拮抗剂,观察PKC是否介导了膜电位去极化引起PIP2水平提高的过程。(4)通过薄层色谱的方法直接测定PIP2含量的变化,观察膜电位去极化和激活PKC对细胞膜PIP2水平的影响。(5)通过使用PKA的拮抗剂,观察PKA是否介导了膜电位去极化引起PIP2水平提高的过程。(6)用膜片钳记录的方法,观察去极化对DRG神经元中内源性表达的M电流和CHO细胞中异源性表达的KCNQ2/Q3电流的作用。结果:(1)通过共表达Ci-VSP,推测去极化可激活PIP2合成。通过薄层色谱的方法证明了膜电位去极化可引起PIP2和PIP水平升高。(2)高渗溶液可通过激活β型PIP 5-激酶而提高PIP2水平。所以如果去极化引起的电流增加依赖PIP2的合成增加,那么用高渗溶液预孵育应可减弱去极化增大KCNQ2/Q3电流的作用。实验结果显示高渗溶液可减弱去极化引起的电流增加。(3)采用wortmannin阻断PI 4-激酶,可基本取消去极化引起的KCNQ2/Q3电流增大作用。(4)PKC的激动剂PMA同样可增大KCNQ2/Q3电流而对KCNQ1无作用。PMA引起的电流增大的时程与去极化引起电流增大的时程相似,且其作用可被去极化的作用所阻断。PKC的阻断剂Bis可取消去极化引起的电流增大作用。但是PMA增大电流的同时,引起KCNQ2/Q3通道的电导-电压关系曲线右移,而对KCNQ1无作用。薄层色谱的方法证明了用PMA激活PKC同样可以提高卵母细胞PIP2和PIP的水平。(5)结果显示:PKA的抑制剂H-89不能阻断去极化引起的KCNQ2/Q3电流增大。提示PKA不是去极化引起的KCNQ2/Q3电流增大的分子学机制(6)去极化(-20 mV)不能增大DRG神经元中内源性表达的M电流及CHO细胞中异源性表达的KCNQ2/KCNQ3电流。PMA(100 nM)可抑制CHO细胞中异源性表达的KCNQ2/KCNQ3电流,而不是激活作用。更大程度的去极化(+20 mV)可逆性抑制DRG神经元中内源性表达的M电流。结论:(1)膜电位去极化引起KCNQ2/Q3增大是通过提高PIP2水平实现。(2)高渗溶液预孵育减弱了去极化增大KCNQ2/Q3电流的作用。(3)去极化引起的PIP2水平升高是由于激活了PI 4-激酶。(4)PKC的激活介导了去极化引起的KCNQ2/Q3电流增大。(5)PKA不是去极化引起的KCNQ2/Q3电流增大的分子学机制。(6)去极化(-20 mV)不能增大DRG神经元中内源性表达的M电流及CHO细胞中异源性表达的KCNQ2/KCNQ3电流。激活PKC可抑制了CHO细胞中异源性表达的KCNQ2/KCNQ3电流。