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第一部分：细胞因子诱导的杀伤细胞体外生物活性的研究目的：探讨细胞因子诱导的杀伤细胞(DC-CIK)的体外生物活性。方法：从白血病患儿外周血分离淋巴细胞,经过IFN-γ、CD3McAb、IL-2诱导并培养,获得大量的DC-CIK。光镜下观察其细胞形态学及动态增殖情况,流式细胞仪检测DC-CIK细胞免疫表型,MTT法研究DC-CIK细胞对多种白血病细胞株的杀伤活性,ELISA方法测定DC-CIK细胞释放细胞因子IL-12、IFN-γ、TNF-α的表达水平。结果：诱导后的DC-CIK细胞形态规则,DC-CIK细胞起初增殖缓慢,第4-8天快速增殖,于第9-10天达到增殖高峰,扩增约100倍。DC-CIK细胞中主要效应细胞是CD3+CD8+双阳性细胞和CD3+CD56+双阳性细胞。MTT结果示DC-CIK对肿瘤细胞B95杀伤作用最强,对Jhhan细胞和M07e细胞杀伤作用较弱。ELISA方法检测,发现诱导培养的DC-CIK细胞上清液中细胞因子IL-12、IFN-γ、TNF-α的分泌水平较高。结论：细胞因子诱导培养的杀伤细胞扩增能力和杀伤能力均较强。Th1细胞因子如IL-12、IFN-γ、TNF-α分泌较高,提示DC-CIK可能通过Th1途径发挥杀伤作用。第二部分：LFA-1/ICAM-1介导的细胞因子诱导的杀伤细胞体外杀瘤机制的研究目的：探讨LFA-1/ICAM-1介导的细胞因子诱导杀伤细胞的体外杀瘤机制。方法：从白血病患儿外周血分离淋巴细胞,经过IFN-γ、CD3McAb、IL-2诱导并培养,获得大量的DC-CIK。在予以10μg/ml、20μg/ml等不同浓度小鼠抗人LFA-1单克隆抗体处理后,采用MTT法研究DC-CIK细胞对多种白血病细胞株的杀伤活性,RT-PCR与Western-Blot方法检测GATA-3和T-bet基因表达水平的变化。ELISA方法测定DC-CIK细胞释放细胞因子IL-12、IFN-γ、TNF-α的表达水平。结果：诱导后的DC-CIK细胞形态规则,在予以10μg/ml、20μg/ml等不同浓度的LFA-1单克隆抗体处理后,MTT结果表明与阴性对照组相比,20μg/ml LFA-1单克隆抗体封闭的实验组DC-CIK细胞对B95细胞杀伤作用下降最为明显,差异有统计学意义(P<0.05),而对Jhhan细胞和M07e细胞杀伤作用均下降,但差异没有统计学意义(P>0.05; P>0.05)。RT-PCR与Western-Blot结果表明与阴性对照组相比,20μg/mlLFA-1单克隆抗体封闭的B95细胞实验组GATA-3基因mRNA水平和蛋白水平表达增加最为明显,差异有统计学意义(P<0.05；P<0.05)。20μg/mlLFA-1单克隆抗体封闭的B95细胞实验组T-bet基因mRNA水平和蛋白水平表达降低最为明显,差异有统计学意义(P<0.05;P<0.05)。ELISA结果表明与阴性对照组相比,20μg/mlLFA-1单克隆抗体封闭的B95细胞实验组DC-CIK细胞上清液中细胞因子IL-12、IFN-γ、TNF-α分泌水平下降最为明显,差异有统计学意义(P<0.05；P<0.05；P<0.05)。结论：GATA-3和T-bet基因参与了LFA-1/ICAM-1介导的DC-CIK杀瘤途径,并且通过分泌Thl型细胞因子IL-12、IFN-γ、TNF-α等发挥杀瘤作用。第三部分：T-bet介导的细胞因子诱导的杀伤细胞体外杀瘤机制的研究目的：研究T-bet介导的细胞因子诱导的杀伤细胞体外杀瘤的作用机制。方法：从白血病患儿外周血分离淋巴细胞,经过IFN-γ、CD3McAb、IL-2诱导,经树突细胞共培养后,获得大量的DC-CIK。在予以1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml等不同浓度小鼠抗人T-bet单克隆抗体处理后,采用MTT法研究DC-CIK细胞对多种白血病细胞株的杀伤活性,流式细胞仪检测CD4+CD25+Treg细胞比例,RT-PCR与Western-Blot方法分别检测Foxp3和GATA-3基因表达水平的变化,ELISA方法测定DC-CIK细胞释放细胞因子IL-12、IFN-γ、TNF-a的表达水平。结果：诱导后的DC-CIK细胞形态规则,在予以1μg/ml、51μg/ml、10μg/ml等不同浓度小鼠抗人T-bet单克隆抗体处理后,MTT结果表明与阴性对照组相比,10μg/mlT-bet单克隆抗体封闭的实验组DC-CIK细胞对B95细胞杀伤作用下降最为明显,差异有统计学意义(P<0.05),而对Jhhan细胞和M07e细胞杀伤作用均下降,但差异没有统计学意义(P>0.05；P>0.05)。流式结果表明与阴性对照组相比,10μg/mlT-bet单克隆抗体封闭的B95细胞实验组CD4+CD25+Treg细胞表达上调最为明显,差异有统计学意义(P<0.05),而Jhhan细胞实验组和M07e细胞实验组CD4+CD25+Treg细胞表达也上调,但差异没有统计学意义(P>0.05;P>0.05)。RT-PCR与Western-Blot结果表明与阴性对照组相比,10μg/mlT-bet单克隆抗体封闭的B95细胞实验组Foxp3基因mRNA水平和蛋白水平表达增加最为明显,差异有统计学意义(P<0.05;P<0.05)。10μg/m1T-bet单克隆抗体封闭的B95细胞实验组GATA-3基因mRNA水平和蛋白水平表达增加最为明显,差异有统计学意义(P<0.05；P<0.05)。ELISA结果表明与阴性对照组相比,10μg/m1T-bet单克隆抗体封闭的B95细胞实验组DC-CIK细胞上清液中细胞因子IL-12、IFN-γ、TNF-a分泌水平下降最为明显,差异有统计学意义(P<0.05；P<0.05；P<0.05)。结论：Foxp3和GATA-3基因参与了T-bet介导的DC-CIK细胞杀瘤途径,其杀瘤机制主要表现为Thl途径活化,而Th2和Treg途径受抑。