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研究背景探讨红细胞增殖分化调控的分子机制,可望为探讨红细胞疾病的发病机理及其防治提供新途径人体内红细胞的数量与骨髓红细胞的增殖、分化密切相关。在生理情况下,红细胞的平均寿命为120天,每天约有1/120的红细胞破坏,同时有相同数量的红细胞产生,使红细胞的生成与破坏之间维持动态平衡。红细胞的生成经历了造血干细胞、红系祖细胞、红系前体细胞的增殖与分化,网织红细胞的增殖及成熟,以及网织红细胞向外周血释放成熟红细胞的过程。在这个复杂的细胞活动过程中,红系细胞与基质细胞之间通过受体与配体的相互接触,以及细胞因子与红系细胞受体之间的相互作用,最终通过不同的信号转导通路启动或关闭一系列的基因,从而实现对红细胞增殖、分化与凋亡的调控。在此过程中每一个环节的异常,都可能导致红细胞的病理生理改变,产生相应的疾病。因此,研究造血干细胞/红系祖细胞的基因表达谱,不断发现新的造血调控因子,探讨红系增殖与分化调控的分子机制,可望阐明红细胞生成的规律,揭示红细胞疾病的发生、发展机制,并为红细胞疾病的预防和治疗提供新的思路和途径。红细胞增殖分化过程主要涉及SCF/c-kit和EPO/EPOR两条信号转导通路一方面,SCF/c-kit通路分别激活Src家族通路（涉及调节因子Src、Yes、Lyn、Fyn、Lck、Blk、Fgr、Hck和Yrk）、PI3K通路（涉及调节因子Akt、GSK3）和PLC-γ通路（涉及调节因子DAG、PIP2、PKC）;EPO/EPOR则分别激活JAK/STAT通路（涉及调节因子JAK1、JAK2、JAK3、TYK2）、RAS/MAPK通路（涉及调节因子Shc、SH2、Grb2、SOS）和PI3K通路（涉及调节因子PKB、Akt、Myr-Akt）。另一方面,SCF/c-kit激活Src,EPO/EPOR激活JAK2后,可共同作用于Ras,进而激活MAPK,引起细胞核内c-jun及c-fos的表达,促进红细胞的增殖分化。可见,红细胞分化发育过程中的两条主要通路SCF/c-kit和EPO/EPOR既可分别发挥作用,又可通过Ras途径互相联系,共同促进红细胞的分化发育。上述细胞信号转导通路异常可导致某些血液系统疾病的发生。hermap基因可能参与红细胞增殖分化过程中的信号转导hermap基因的发现:Ye等[1 ]在国际上首先从小鼠胚胎红细胞cDNA文库中筛选出编码红细胞膜相关蛋白（erythroid membrane associated protein,ERMAP）的基因。随后Su等[ 2]从人胎肝cDNA文库中筛选出了人类ermap（human ermap,hermap）基因。与此同时,Xu等[ 3]又从妊娠第10周及22周胎肝消减cDNA文库中筛选出hermap基因。hermap基因高度特异表达于造血组织及红系细胞中:本课题组的前期研究显示:①hermap基因高度特异地表达于K562、HEL细胞系,以及胎儿肝脏和骨髓、成人骨髓等造血组织[ 2,5] ;②在阿糖胞苷（Ara-C）诱导K562细胞向红细胞系方向分化的过程中,hermap基因的表达量逐渐增加,而在十二氟波酯钠盐（TPA）诱导K562细胞向巨噬系方向分化的过程中,hermap基因的表达量却无变化[ 4];③以含hermap-siRNA的质粒转染K562细胞后,可抑制AraC诱导K562细胞向红系的分化,在此过程中,hermap基因的表达量下降;④在SCF、IL-3和EPO体外诱导脐血MNCs向红细胞系增殖分化的过程中,hermap基因的表达量逐渐升高,其趋势与红细胞分化发育过程一致[ 6];⑤采用Northern Blot方法研究显示[ 7],hermap基因在25 +5周胎儿肝脏和骨髓中表达阳性,而在胎儿脾脏、肾脏、胸腺、心脏、肺脏、大脑及肌肉中表达阴性。进一步以FQ-PCR方法研究显示,hermap基因在胎儿肝脏中表达是从第12周开始升高,18～20周达高峰,21周后开始下降并稳定于较低水平,与胚胎肝脏造血过程基本一致。hermap在胎儿骨髓中的表达则从15周开始,27～32周达高峰,之后迅速下降,其表达规律与胎儿期骨髓造血过程基本一致。但妊娠32周后骨髓造血活动仍然存在,而hermap基因的表达量却迅速下降。hermap基因可能参与红细胞增殖分化过程中的信号转导:Ye [1 ,2]的研究还显示:hermap基因编码由475个氨基酸组成的跨膜蛋白。通过对HERMAP蛋白结构域与其它已知蛋白结构域的比较,显示HERMAP的主要结构为:①胞外部分含有一个IgV区域,与Ig-like、Ig-likefold结构域具有高度的同源性。前者存在于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、淋巴细胞活化信号分子及受体酪氨酸激酶等分子中。后者则存在于CD3信号分子复合物、酪氨酸激酶跨膜受体等分子中。上述激酶和信号分子都参与了细胞内的信号转导;②IgV区域内有一段与髓磷脂/少突胶质细胞糖蛋白（MOG）的同源序列,其内有一免疫球蛋白重链C1q识别区。C1q是一种巨噬细胞跨膜蛋白,可能参与了巨噬细胞的胞吞作用。在人类多发性硬化症的病理过程中,MOG可与C1q结合。因此推测,HERMAP中的MOG可能通过与C1q结合而参与红细胞和巨噬细胞之间的相互作用;③HERMAP的胞内部分有一个B30.2区域,该区域与泌乳糖蛋白（butyrophylin）、SPRY和TRIM家族具有高度同源性。SPRY是一种功能尚未完全明确的结构域,目前已知它与肌醇三磷酸受体介导的Ca 2+的储存和释放、蛋白质-蛋白质之间的相互作用等有关。胞内信号分子中相互作用的实质是蛋白质与蛋白质之间的作用,因此推测该区域可能与ERMAP与胞内激酶的相互作用有关;④此外,HERMAP的细胞内部分还包含一些重要的结构域,如磷酸化结构域、SH3结合区结构域、双亮氨酸结构域等[ 3,4] ,这些结构域是胞内信号分子之间相互作用的重要结构域。课题的提出:hermap基因参与红细胞增殖分化过程中的细胞信号转导?综合上述,hermap基因编码红细胞跨膜蛋白,属免疫球蛋白超家族成员,高度特异地表达于K562细胞和HEL细胞系以及胎儿肝脏和骨髓、成人骨髓等造血组织。根据其基因表达谱研究结果,推测hermap基因的功能可能与红细胞系增殖分化有关,在胚胎发育过程中,可能还参与了红系细胞向肝脏和骨髓的迁移活动。通过对其蛋白质结构域与其它已知蛋白结构域的比较,推测hermap基因在红细胞系增殖分化过程中,可能参与了细胞内的信号转导。但是,对于hermap确切的功能及其作用机理,尚未明了。基于上述,本课题拟建立上调及下调hermap基因表达的K562细胞系,并以Ara-C诱导其向红细胞分化发育,在此过程中,观察hermap基因对红细胞信号转导通路的影响,以期找出HERMAP和红细胞信号转导通路之间的联系。以期为探讨hermap基因在红细胞增殖分化过程中的作用,揭示其与红细胞疾病的关系,并为发现新的调控红细胞分化发育的信号分子,提供新的依据和思路。研究目的通过分别建立pEGFP-C1-hermap及pRNATH1.1-GFP/ Neo-hermap siRNA稳定转染的K562细胞系,观察上调及下调hermap基因的表达对AraC诱导K562细胞向红细胞系分化过程中细胞信号转导通路的影响,探讨hermap基因在红细胞分化发育过程中的作用。研究方法1. pEGFP-C1-hermap及pRNATH1.1-GFP/ Neo-hermap siRNA的构建1.1 pEGFP-C1-hermap的构建设计分别带有BamHI和EcoRV酶切位点的上下游引物,利用RT-PCR从K562细胞cDNA中扩增hermap的编码序列,扩增片断大小为1428bp。hermap编码序列插入到带有BglII和SmaI酶切位点的pEGFP-C1载体,所构建的载体通过酶切及测序鉴定。1.2 pRNATH1.1-GFP/Neo-hermap siRNA的构建针对靶基因hermap （NM001017922）进行设计,从中筛选出1对靶向hermap的siRNA序列,体外合成用于淬火的双链DNA分子两端各带有BamHI和HindⅢ酶切位点,与带有相同酶切位点的载体pRNAT-H1.1-GFP连接。所构建的载体通过酶切及测序鉴定。2.pEGFP-C1-hermap和pRNATH1.1-GFP/ Neo-hermap siRNA稳定转染K562细胞的筛选采用稳定转染法分别将重组pEGFP-C1-hermap质粒及hermap-siRNA-pRNAT质粒转染入K562细胞,经G418筛选出稳定表达hermap和hermap-siRNA的两个K562细胞系。3.AraC诱导hermap/K562细胞和hermap-siRNA/K562细胞向红细胞分化实验分为hermap组、hermap-siRNA组、空质粒组及空白组,加入Ara-C（10-5m M）后,于0h、24h、48h、72h和96h检测hermap基因的表达量,同时,分别观察细胞形态、联苯胺染色阳性率、细胞表面标记（CD235a+/CD36-、CD235a+/CD36+和CD235a-/CD36+）、Aγ、Gγ珠蛋白基因的表达量,以证实其是否向红系分化。4.上调及下调hermap基因的表达对红细胞分化发育过程中细胞信号转导通路的影响在Ara-C诱导上述K562细胞向红系细胞分化的过程中,分别于0h、24h、48h、72h、96h检测细胞信号转导通路中关键磷酸化激酶p-STAT5、p-Akt、p-MAPK、p-c-Jun等的变化,并分析其与hermap基因表达量的关系。研究结果1.构建了hermap-pEGFP及hermap-siRNA-pRNAT的真核表达载体测序结果显示hermap-pEGFP及hermap-siRNA-pRNAT真核表达质粒所携带的目的基因长度分别为1428bp和55bp,其序列与hermap及设计的hermap-siRNA序列一致。2.建立了稳定表达hermap和hermap-siRNA的两个K562细胞系采用稳定转染法将hermap-pEGFP及hermap-siRNA-pRNAT的真核表达载体转染入K562细胞,经G418筛选后,在荧光显微镜下可见绿色荧光,初步证明细胞可稳定表达hermap基因或hermap-siRNA。3.上调hermap基因的表达可促进Ara-C诱导K562细胞向红系分化发育的过程,而下调hermap基因的表达则可遏制这一过程在Ara-C诱导过程中,K562细胞出现以下变化:①细胞形态:4组细胞的体积逐渐减小,核浆比例逐渐减小,胞浆染色从深蓝色转变成蓝紫色或浅红色,核染色质逐渐浓集、皱缩。提示K562细胞逐渐向早、中、晚幼红细胞分化;②联苯胺染色阳性率:hermap组在Ara-C诱导后24h、48h、72h和96h,细胞联苯胺染色阳性率逐渐增加（p<0.05）,在上述各个时点均高于其他各组（p<0.05）;hermap-siRNA组在诱导24h,细胞联苯胺染色阳性率无明显变化（p>0.05）,48h、72h、96h后,细胞联苯胺染色阳性率逐渐增加（p<0.05）,在上述各时点均低于其他各组（p<0.05）;③CD235a+/CD36-、CD235a+/CD36+和CD235a-/CD36+细胞比例:在Ara-C诱导后24h、48h、72h和96h,4组上述标记阳性的细胞比例均逐渐增加（p<0.05）,在上述各时点,hermap组最高,而hermap-siRNA组最低;④Aγ、Gγ珠蛋白基因表达量:hermap组在Ara-C诱导后24h、48h、72h和96h,Aγ基因的表达量逐渐增加（p<0.05）,且在上述各个时点均高于其他各组（p<0.05）;诱导后24h,Gγ基因的表达量无明显变化（p>0.05）,48h、72h、96h后,其表达量逐渐增加（p<0.05）;hermap-siRNA组在Ara-C诱导后24h,Aγ基因的表达量无明显变化（p>0.05）,48h、72h和96h表达量逐渐增加,48h、96h均低于其余3组（p<0.05）;随着培养时间的延长,Gγ珠蛋白基因的表达量增加（p<0.05）。4.上调或下调hermap基因的表达可引起磷酸化激酶p-STAT5、p-c-Jun的变化随着Ara-C诱导时间的延长,4组p-STAT5阳性细胞的比例均逐渐增加,hermap组p-STAT5阳性细胞比例与hermap基因的增加具有正相关性,其余3组均与hermap的变化无相关性（p>0.05）;hermap组p-c-Jun阳性细胞比例也逐渐增加,与hermap基因的增加呈正相关;hermap-siRNA组p-c-Jun阳性细胞比例24h达最高,其后逐渐下降,在培养的各个时点高于其余3组,且与hermap基因表达量具有负相关性;4组p-MAPK阳性细胞、p-Akt阳性细胞比例与hermap基因的表达量无相关性（p<0.05）。结论1.本研究构建了hermap-pEGFP及hermap-siRNA-pRNAT的真核表达载体。2.建立了稳定表达hermap和hermap-siRNA的两个K562细胞系,并证实这两种细胞系可分别稳定表达hermap和hermap-siRNA,为进一步研究奠定了基础。3.上调hermap基因可促进Ara-C诱导K562细胞向红系分化发育的过程,而下调hermap基因则可遏制该过程,进一步提示hermap与红系分化发育密切相关。4.ERMAP对红细胞分化发育的影响可能是通过JAK/STAT5通路实现的。然而,在红细胞分化发育过程的细胞信号转导通路中,与ERMAP作用的蛋白是什么?蛋白质与蛋白质之间的作用机理如何?等等,仍有待近一步研究。