在美国胰腺癌是第四大癌症致死原因，5年生存率仅为6%。在过去20年中胰腺癌病人的预后基本没有得到改善，部分原因是由于诊断的延误，许多病例诊断时已属晚期。从2005年起，该疾病的标准化疗采用核苷类似物吉西他滨和激酶抑制剂埃罗替尼联合,然而，其疗效仍然很低，中位生存期只有8.5个月，而1年生存率则仅有35%。因此，急需新的治疗方法来提高对胰腺癌患者的疗效。抗凋亡Bcl-2家族蛋白如Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1的过表达，是诱发化疗抗性的一个常见原因。因此，以这些蛋白为靶点有可能有效地治疗胰腺癌。Obatoclax （GX15-070）是一个能与Bcl-2、 Bcl-xL和Mcl-1的BH3结合位点相结合的广谱Bcl-2小分子抑制剂。已有报道表明，这一广谱Bcl-2抑制剂可以在肿瘤细胞株和临床样本中通过线粒体凋亡途经直接诱导凋亡或非凋亡性的细胞死亡。最近研究揭示，抗凋亡Bcl-2家族蛋白除了拥有抗凋亡功能外，还可以调节DNA双链断裂的修复。PARP1是一种DNA结合蛋白，参与凋亡和DNA单链、双链断裂修复，并逐渐成为治疗多种不同肿瘤的一个靶点。在BRCA1/2缺陷型肿瘤中PARP抑制剂，如Olaparib（AZD2281），展现了很强的联合致死效应。而且，PARP抑制剂的使用最近已被扩展到治疗其它具有DNA同源重组路径缺陷的肿瘤或与化疗药物和放化疗联合使用上。联合PARP抑制剂和其他损害DNA损伤修复的药物一同治疗BRCA1/2野生型肿瘤可以扩展这些充满前景的PARP抑制剂的临床使用范围。我们假设广谱Bcl-2抑制剂可以使胰腺癌细胞对PARP抑制剂更加敏感，原因是Bcl-2家族成员和PARP都与凋亡和DNA损伤修复有关。为了检测这种可能性，我们使用MTT法和流式细胞术来考察GX15-070和AZD2281单药及联合用药对6株表达不同水平的PARP1、Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1的胰腺癌临床相关细胞株ASPC-1, BxPC-3, CFPAC-1, HPAC, MIAPaCa-2,和PANC-1的抗肿瘤效果。这两种药都引起了细胞生长抑制，然而却只引起很有限的凋亡。而且，单药的敏感性看起来与PARP1、Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1蛋白水平无关。当AZD2281与临床可使用浓度的GX15-070同时使用时，我们用CalcuSyn软件和标准等效线图解法分析，得到叠加到协同的抗肿瘤作用。同时用药相对于单独用药导致死亡细胞比例的显著升高。与此相似，用shRNA在胰腺癌细胞中沉默PARP1基因也显著增强了GX15-070引起的细胞死亡。此外，AZD2281和GX15-070联合用药相对于单药处理更加显著地抑制了细胞集落的形成，而且CalcuSyn软件分析表明二者对细胞集落形成的抑制作用是协同的。然而，我们没有检测到割裂的caspase-3和PARP1，这预示GX15-070和AZD2281引起的细胞死亡是通过非凋亡性细胞死亡机制。与上述结果相一致，用PI染色和流式细胞术并未在联合用药处理过的胰腺癌细胞中检测到sub-G1期细胞比例的提高。对BxPC-3细胞的细胞周期分析显示，AZD2281单药处理后有G2/M期的少量升高，加入GX15-070后G2/M期有进一步的显著升高，这一显著升高伴随着CDK1蛋白水平的降低。在PANC-1细胞中，我们检测到AZD2281单药处理后有S期的少量升高，加入GX15-070后S期有进一步的显著升高，并伴随着CDK2蛋白水平的少量降低。这些结果进一步显示GX15-070并没有通过传统的凋亡机制来增强AZD2281的细胞毒性作用。联合用药处理相对于对照处理引起了Bcl-2水平的少量降低，这意味着药物诱导的非凋亡性细胞死亡可能是由于Bcl-2蛋白水平的降低而导致的。奇怪的是，在荷瘤裸鼠体内实验中，单药和联合用药处理并未导致显著的外部可测的肿瘤生长延迟，显示缺乏药物治疗反应。然而，联合组血清的CA19-9（一个用来监测化疗应答的胰腺癌生物标志物）的水平与其它组相比显著降低，显示了治疗反应。H&E染色显示，与对照组相比，药物处理组的肿瘤坏死区增大，尤其是联合用药组的肿瘤坏死区增加更加显著。免疫组化的结果与H&E染色结果一致，联合组与其它组相比，PCNA和CD34的表达明显降低。这些结果显示，GX15-070和AZD2281配合抑制了肿瘤中胰腺癌细胞的增殖和血管生成。综上所述，本论文的研究结果表明在临床前模型中，GX15-070和AZD2281对胰腺癌具有协同抗肿瘤活性。虽然还没有直接的证据，我们怀疑GX15-070主要通过抑制Bcl-2、Bcl-xL和/或Mcl-1非凋亡功能来增强PARP抑制剂AZD2281的细胞毒性作用。这个推断还需要进一步的研究来验证。无论如何，我们的最新研究结果显示用GX15-070和AZD2281联合治疗胰腺癌可能具有临床益处。基于Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1在线粒体凋亡途经中所起的重要作用，GX15-070处理应该引起细胞凋亡。然而，在临床可达到的浓度下，GX15-070只引起少量的细胞凋亡，这意味着存在其它机制阻止GX15-070诱导胰腺癌细胞凋亡。文献报道指出，抗凋亡Bcl-2家族蛋白在抑制凋亡的同时还可以抑制自噬。我们推断GX15-070在胰腺癌细胞中诱导自噬，而自噬促进胰腺癌细胞的生存。因此，添加自噬抑制剂也许可以提高GX15-070诱导的凋亡。氯喹作为溶酶体pH抑制剂而能防止自噬体和溶酶体的融合从而抑制自噬的后期阶段。由于氯喹是一个耐受性较好的药物，因而以其单独或与其他药物联合治疗癌症将有较好的临床应用前景。一些新发现已经促使联合应用自噬抑制剂和化疗药物对各种类型癌症进行临床试验。目前，应用氯喹单独治疗胰腺癌的临床试验正在进行(http://www.clinicaltrials.gov: NCT01273805)。因此，我们选择氯喹与GX15-070联合使用。正如所预计的，GX15-070在胰腺癌细胞中的确诱导了自噬，这反映在它在细胞中以浓度依赖的方式诱导了LC3B-II。透射电子显微镜分析显示用GX15-070处理胰腺癌细胞，增加了自噬小体的数目，进一步证实了GX15-070诱导了自噬。通过MTT试验和CalcuSyn软件分析确定了同时使用GX15-070和氯喹处理胰腺癌细胞导致了叠加到协同的抗肿瘤效果。并且，这两个药协作性地诱导了胰腺癌细胞的凋亡。用这两个药联合处理与两个药单独处理相比，导致Bcl-2蛋白水平的明显降低，并伴随着DNA双链断裂的发生。这些结果支持联合氯喹和Bcl-2抑制剂治疗胰腺癌。总之，AZD2281或氯喹协同提高了GX15-070对胰腺癌细胞的体外抗肿瘤活性。并且，在体内肿瘤移植模型中与单药相比，AZD2281和GX15-070联合显著地增加了肿瘤的坏死。我们的结果预示，同时使用GX15-070和AZD2281或氯喹治疗胰腺癌病人可能会有较好的疗效。