研究目的:肾癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,由于肾癌对放化疗均不敏感,治疗方式仍以手术为主。目前早期肾癌行根治性切除术术后预后较好,晚期肾癌特别是有远处转移的病例治疗仍具有一定局限性。所以明确肾癌发病机制及寻找有效治疗手段对于肾癌特别是晚期肾癌是迫切需要的。sigma受体,分为sigma-1和sigma-2两个亚型,sigma-1受体在调节细胞存活、细胞分化及肿瘤发生发展中起重要作用。sigma-2受体的研究一直受到限制因为编码sigma-2受体的基因一直未被发现,所以,多年来关于sigma-2受体的研究一般依赖其激动剂、抑制剂或放射性核素示踪。直到2017年,美国科学家证实编码sigma-2受体的基因为TMEM97。大量研究表明TMEM97参与多种肿瘤的发生发展,但在肾癌中报道较少。因此,我们以此为切入点,首先通过数据库分析及组织标本检测探寻TMEM97在肾癌组织中的表达情况及与预后的关系;接下来选择sigma-2受体特异性激动剂和抑制剂、敲除或过表达TMEM97,利用体外和体内实验中共同验证TMEM97在肾癌中发挥的生物学作用;最后肾癌细胞过表达TMEM97后进行转录组测序,筛选出关键的差异因子,以及主要影响的信号通路,为深入揭示肾癌进展及预后不良的生物学机制提供坚实的理论基础。研究方法:1、TMEM97在肾癌组织中的表达及与预后相关性分析从标本库中随机选取肾癌及其癌旁组织标本,提取总蛋白或制成石蜡切片,利用Western blot技术及免疫组化技术明确TMEM97的表达情况。通过ONCOMINE数据库、THE HUMAN PROTEIN ALTAS等网上公共数据库,查询TMEM97对于肾癌预后的影响。利用生物信息学分析找到在肾癌中TMEM97主要富集到哪些信号通路。2、sigma-2受体特异性激动剂和抑制剂对肾癌细胞生物学功能的影响选择sigma-2受体特异性激动剂PB28和特异性抑制剂sigma-2 receptor antagonist 1作用于肾癌细胞,利用克隆形成实验、transwell实验及划痕实验验证PB28和sigma-2 receptor antagonist 1对于肾癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响。3、siRNA干扰技术、质粒转染及慢病毒转染技术验证TMEM97在肾癌中的生物学功能利用TMEM97的si-RNA、sh-RNA及过表达慢病毒转染肾癌细胞系,应用western blot实验验证TMEM97的转染效率。利用RTCA（Real Time Cellular Analysis）实时增殖实验,克隆形成实验,transwell实验,划痕实验等检测手段进行细胞增殖、侵袭及迁移能力的检测。4、体内实验验证TMEM97在肾癌中的生物学功能利用质粒、慢病毒转染技术构建稳定敲除或过表达TMEM97的肾癌细胞系,分别进行裸鼠皮下成瘤实验及尾静脉注射肾癌细胞观察肺转移灶的实验。首先选择4-6周的Balb/c裸鼠右侧腋下注射肾癌细胞,观察移植瘤的生长情况,约3-4周后处死。对不同组别肿瘤进行称重。取皮下移植瘤进行免疫组化实验检测Ki-67及TMEM97的表达。接下来,过表达TMEM97的肾癌细胞系及对照组细胞系注射入裸鼠的尾静脉,观察60天后处死,取裸鼠肺组织观察转移灶的数量。5、TMEM97的敲除或过表达对EMT蛋白和PI3K-AKT-mTOR通路相关蛋白表达影响Western blot实验检测PB28、sigma-2 receptor antagonist 1处理后;siRNA、质粒或慢病毒转染后,EMT相关蛋白的表达变化。Western blot实验检测PB28处理后;siRNA、质粒或慢病毒转染后,PI3K-AKT-mTOR通路相关蛋白的表达变化。6、TMEM97进行慢病毒过表达转染后转录组改变使用慢病毒转染技术构建稳定过表达TMEM97的肾癌细胞系,将此实验组和对照组进行转录组学测序检测。分析转录组差异蛋白及差异通路。分析出的结果进行验证。结果:1、Western blot实验证实,63对肾透明细胞癌组织中TMEM97在肾癌及癌旁组织中表达无明显差异,但T分期较早的肾透明细胞癌中,TMEM97高表达。免疫组化实验结果表明,Fuhrman核分级越高,TMEM97表达越低。通过ONCOMINE、THE HUMAN PROTEIN ALTAS等网上公共数据库查询发现,肾透明细胞癌中TMEM97表达越低,预后越差。生物信息学分析结果提示,TMEM97在肾透明细胞癌中和PI3K-AKT-mTOR通路呈正相关。2、四种肾癌细胞系786-O、ACHN、Caki-1及OSRC-2中,TMEM97在786-O和ACHN细胞中表达量较高,在Caki-1和OSRC-2细胞的表达量较低。克隆形成实验结果证实,sigma-2受体激动剂PB28能够抑制肾癌细胞增殖;sigma-2受体抑制剂sigma-2 receptor antagonist 1能够诱导肾癌细胞增殖。Transwell实验及划痕实验结果表明,sigma-2受体激动剂PB28能够抑制肾癌细胞侵袭及迁移;而sigma-2受体抑制剂sigma-2 receptor antagonist 1能够诱导肾癌细胞侵袭及迁移。3、利用质粒或慢病毒转染技术处理肾癌细胞,发现敲除TMEM97后,肾癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力明显增强;过表达TMEM97后,肾癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力明显受抑制。在动物模型中,敲除TMEM97后,裸鼠皮下成瘤能力增强;过表达TMEM97后,裸鼠皮下成瘤能力减弱。TMEM97敲除组皮下肿瘤Ki-67染色较对照组增强,TMEM97过表达组皮下肿瘤Ki-67染色较对照组减弱。并且过表达TMEM97后,裸鼠肺转移灶数量减少。4、Western blot实验结果证实肾癌细胞中加入sigma-2受体抑制剂sigma-2receptor antagonist 1或敲除TMEM97后,EMT相关蛋白（N-cadherin和Vimentin）表达升高;肾癌细胞中加入sigma-2受体激动剂PB28或过表达TMEM97后,EMT相关蛋白（N-cadherin和Vimentin）表达降低。5、PB28作用于肾癌细胞后,发现PI3K-AKT-mTOR通路蛋白磷酸化受抑制。小RNA干扰技术、质粒转染技术敲除TMEM97后PI3K-AKT-mTOR通路被激活。慢病毒过表达TMEM97后PI3K-AKT-mTOR通路受到抑制。6、肾癌细胞经慢病毒转染稳定过表达TMEM97,将此实验组和对照组进行转录组学测序检测。KEGG分析发现,过表达TMEM97后,PI3K-AKT-mTOR通路受抑制。GO分析提示过表达TMEM97主要影响Regulation of lipid metabolic process、cell migration、lipid localization、membrane region、sterol binding、growth factor binding、cholesterol transporter activity。差异基因变化较明显的是SCD。随后经过生物信息学分析查阅数据库筛选出有13个转录因子和SCD相关,再通过TCGA等数据库分析出ETS1,TFAP2A,NR3C1与SCD最明显相关。Western blot实验证实细胞过表达TMEM97后,SCD及转录因子ETS1表达明显下降。结论:TMEM97在分期较早的肾透明细胞癌中高表达。Sigma-2受体激动剂PB28作用于肾癌细胞或肾癌细胞过表达TMEM97能够抑制肾癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力;Sigma-2受体抑制剂sigma-2 receptor antagonist 1作用于肾癌细胞或肾癌细胞敲除TMEM97能够促进肾癌细胞的增殖、侵袭及迁移。肾癌细胞过表达TMEM97或加入PB28对肾癌细胞的抑制作用是通过抑制PI3K-AKT-mTOR通路实现的;肾癌细胞敲除TMEM97则能够诱导PI3K-AKT-mTOR通路蛋白表达。体外及体内实验共同证明TMEM97在肾癌中起抑制作用。并且肾癌中TMEM97发挥抑制作用是通过抑制SCD的转录因子ETS1的表达从而抑制肾癌细胞脂代谢实现的。