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药效机理和药物生物分布是影响药效作用的两个重要因素。作为临床药物中的主要成分之一,羟基红花黄色素A(HYSA)的神经保护作用及机制已有大量研究,但其在脑缺血-再灌注(IR)损伤中关于细胞焦亡的机制尚不明确。另一方面,由于HSYA是亲水性药物,血脑屏障(BBB)透过率低,无法发挥药效作用。
目的:为了研究HSYA对体内外实验中细胞焦亡相关因子NLRP3,ASC,Caspase-1,GSMDD,IL-1β,IL-18,LDH,NF-κB和p-p65的调节作用。同时,为了改善其缺陷,进一步提高HSYA的治疗效果,本研究联用了腺苷受体激动剂Lexiscan(Lex),探究Lex是否可以通过协助HSYA通过细胞旁路穿过BBB到达病灶部位,以提高HSYA在脑病灶部位的富集,提升HSYA对IR损伤的治疗效果。
方法:(1)HSYA对IR损伤中细胞焦亡通路的调节作用:建立体外氧化应激损伤模型,用MTT法和活/死细胞实验检测HSYA对PC12损伤细胞的体外保护作用;通过qRT-PCR、Western-blot法和ELISA实验,分别从mRNA转录和蛋白表达水平检测HSYA对损伤细胞NLRP3,ASC,Caspase-1,GSMDD,IL-1β,IL-18,LDH,NF-κB和p-p65因子的调节作用;建立大鼠中动脉阻塞(MCAO)模型,系统评价HSYA对大鼠神经行为、脑梗死、脑水肿和组织病理学的影响,并在体内验证HSYA对损伤脑组织中NLRP3,ASC,Caspase-1和GSDMD蛋白的影响。
(2)Lex联合HSYA(Lex-HSYA)给药对IR损伤的药效研究:通过b.End3细胞、C6细胞共培养,建立体外BBB模型,检测Lex对BBB上P-gp、F-actin蛋白的作用,并用HRP示踪法验证Lex对体外BBB的调节作用;EvansBlue法、内源性IgG蛋白检测分析Lex对药物在脑内滞留时间的影响,并在透射电镜下观察Lex对BBB超微结构的影响;通过小动物活体成像实时监测体内荧光变化,HPLC检测脑内药物实际含量,以探究Lex对药物体内分布的影响;建立大鼠MCAO模型,系统评价Lex-HSYA的药效学作用。
结果:(1)HSYA对IR损伤中细胞焦亡通路的调节作用:HSYA能降低H2O2对细胞的毒性损伤,发挥其保护作用。HSYA给药后,NLRP3,ASC,Caspase-1,GSMDD,IL-1β,IL-18和LDH的mRNA转录水平和蛋白表达量均呈现显著下降趋势,说明HSYA可以抑制细胞焦亡通路。同时,HSYA可以抑制NF-κB信号通路,进而减轻神经细胞损伤。在HSYA的体内药效实验中,相对于Model组,高剂量HSYA给药能够有效抑制NLRP3,ASC,Caspase-1和GSDMD蛋白的表达,降低大鼠脑梗死体积,减少脑组织胞膜破碎、细胞间隙变宽等情况,改善神经损伤,发挥神经保护作用。
(2)Lex-HSYA对IR损伤的药效研究:成功建立体外BBB模型。Lex能显著减少P-gp蛋白的表达,抑制P-gp在BBB上发挥外排作用;Lex能降低F-actin的表达,使BBB的细胞间隙增大;最后HRP示踪法检测到Lex能使体外BBB透过量显著增加。体内验证中,Lex可以使正常大鼠脑组织皮层渗入EB染料,Lex组内源性IgG蛋白泄漏量和模型组相似,即说明Lex可以增大正常大鼠脑组织BBB通透性;Lex也可以通过改变BBB的超微结构而影响BBB的通透性,以促进药物在脑内的富集。HSYA当量的Cy7染料能实时监测脑中荧光变化,Cy7-Lex组比Cy7组显示出更强的荧光信号且富集时间更长,说明Lex可以增加药物在脑内的浓度和停留时间。HPLC法检测出Lex-HSYA组中HSYA含量更高,即Lex能增加脑内HSYA的浓度。体内药效实验中Lex能促进HSYA在脑内富集,改善组织病理学形态,并促进神经营养因子的产生以减轻脑缺血损伤,增强药物治疗效果。
结论:HSYA通过抑制IR损伤时NLRP3,ASC,Caspase-1,GSMDD,IL-1β,IL-18,LDH,NF-κB和p-p65因子的表达,发挥神经保护作用,因此,细胞焦亡通路可以作为HSYA在神经损伤治疗中新的治疗靶点。同时,Lex能增加HSYA在BBB内的富集,显著减少脑梗死体积,改善组织病理学形态,并促进神经营养因子的产生,减轻IR损伤,因此Lex-HSYA有望成为神经损伤治疗的候选药物。并且,本研究为血脑屏障调节剂Lex应用于建立跨血脑屏障通道提供了新的证据。
目的:为了研究HSYA对体内外实验中细胞焦亡相关因子NLRP3,ASC,Caspase-1,GSMDD,IL-1β,IL-18,LDH,NF-κB和p-p65的调节作用。同时,为了改善其缺陷,进一步提高HSYA的治疗效果,本研究联用了腺苷受体激动剂Lexiscan(Lex),探究Lex是否可以通过协助HSYA通过细胞旁路穿过BBB到达病灶部位,以提高HSYA在脑病灶部位的富集,提升HSYA对IR损伤的治疗效果。
方法:(1)HSYA对IR损伤中细胞焦亡通路的调节作用:建立体外氧化应激损伤模型,用MTT法和活/死细胞实验检测HSYA对PC12损伤细胞的体外保护作用;通过qRT-PCR、Western-blot法和ELISA实验,分别从mRNA转录和蛋白表达水平检测HSYA对损伤细胞NLRP3,ASC,Caspase-1,GSMDD,IL-1β,IL-18,LDH,NF-κB和p-p65因子的调节作用;建立大鼠中动脉阻塞(MCAO)模型,系统评价HSYA对大鼠神经行为、脑梗死、脑水肿和组织病理学的影响,并在体内验证HSYA对损伤脑组织中NLRP3,ASC,Caspase-1和GSDMD蛋白的影响。
(2)Lex联合HSYA(Lex-HSYA)给药对IR损伤的药效研究:通过b.End3细胞、C6细胞共培养,建立体外BBB模型,检测Lex对BBB上P-gp、F-actin蛋白的作用,并用HRP示踪法验证Lex对体外BBB的调节作用;EvansBlue法、内源性IgG蛋白检测分析Lex对药物在脑内滞留时间的影响,并在透射电镜下观察Lex对BBB超微结构的影响;通过小动物活体成像实时监测体内荧光变化,HPLC检测脑内药物实际含量,以探究Lex对药物体内分布的影响;建立大鼠MCAO模型,系统评价Lex-HSYA的药效学作用。
结果:(1)HSYA对IR损伤中细胞焦亡通路的调节作用:HSYA能降低H2O2对细胞的毒性损伤,发挥其保护作用。HSYA给药后,NLRP3,ASC,Caspase-1,GSMDD,IL-1β,IL-18和LDH的mRNA转录水平和蛋白表达量均呈现显著下降趋势,说明HSYA可以抑制细胞焦亡通路。同时,HSYA可以抑制NF-κB信号通路,进而减轻神经细胞损伤。在HSYA的体内药效实验中,相对于Model组,高剂量HSYA给药能够有效抑制NLRP3,ASC,Caspase-1和GSDMD蛋白的表达,降低大鼠脑梗死体积,减少脑组织胞膜破碎、细胞间隙变宽等情况,改善神经损伤,发挥神经保护作用。
(2)Lex-HSYA对IR损伤的药效研究:成功建立体外BBB模型。Lex能显著减少P-gp蛋白的表达,抑制P-gp在BBB上发挥外排作用;Lex能降低F-actin的表达,使BBB的细胞间隙增大;最后HRP示踪法检测到Lex能使体外BBB透过量显著增加。体内验证中,Lex可以使正常大鼠脑组织皮层渗入EB染料,Lex组内源性IgG蛋白泄漏量和模型组相似,即说明Lex可以增大正常大鼠脑组织BBB通透性;Lex也可以通过改变BBB的超微结构而影响BBB的通透性,以促进药物在脑内的富集。HSYA当量的Cy7染料能实时监测脑中荧光变化,Cy7-Lex组比Cy7组显示出更强的荧光信号且富集时间更长,说明Lex可以增加药物在脑内的浓度和停留时间。HPLC法检测出Lex-HSYA组中HSYA含量更高,即Lex能增加脑内HSYA的浓度。体内药效实验中Lex能促进HSYA在脑内富集,改善组织病理学形态,并促进神经营养因子的产生以减轻脑缺血损伤,增强药物治疗效果。
结论:HSYA通过抑制IR损伤时NLRP3,ASC,Caspase-1,GSMDD,IL-1β,IL-18,LDH,NF-κB和p-p65因子的表达,发挥神经保护作用,因此,细胞焦亡通路可以作为HSYA在神经损伤治疗中新的治疗靶点。同时,Lex能增加HSYA在BBB内的富集,显著减少脑梗死体积,改善组织病理学形态,并促进神经营养因子的产生,减轻IR损伤,因此Lex-HSYA有望成为神经损伤治疗的候选药物。并且,本研究为血脑屏障调节剂Lex应用于建立跨血脑屏障通道提供了新的证据。