研究背景肝癌（Liver Cancer）是严重危害人类健康的重大疾病,其中肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）占85%-90%,我国HCC发生率、患病率、死亡率均居全球前列。病因学研究发现,非遗传因素包括病毒感染﹑黄曲霉毒素误食﹑亚硝酸盐长期食用、药物性肝损、过度性饮酒,以及特种作业环境特别是军事作业环境下有机磷化合物、偶氮芥类化合物、重金属（砷、镉、铜、汞等）等长期接触和携带性食入,均是诱发HCC发生的重要因素。因此研究HCC的防治策略不但有利于提高HCC治疗效果,还对特种医学和军事职业危害防治体系的补充和完善意义重大。目前,HCC临床治疗现状仍有待提高。近年来,抗HCC治疗研究逐渐深入,开发了包括介入治疗（TACE）、纳米载药、多靶点酪氨酸激酶抑制剂TKIs、CAR-T细胞治疗等方法和药物,虽然整体疗效欠佳,但这些“靶向癌细胞生物学特性”的研究为抗HCC的研究提供了重要的参考和思路。异常高的铁代谢是肿瘤细胞维持高增殖﹑转移和侵袭能力最重要的物质基础之一,肿瘤细胞对铁的大量需求和快速耗竭所特有的“铁成瘾（Iron Addiction）”已经被标记为肿瘤最重要的生物学特征之一。在HCC铁代谢干预研究中发现,以螯合降低铁过载的生长阻滞和加剧促进铁过载的铁死亡（Ferroptosis）为策略的两种方法均显示了“铁代谢干预”在抗肿瘤中的价值,但安全性和靶向性仍未能得到很好的解决,导致“铁代谢干预”抗肿瘤的策略应用受限。寻找低毒、高效、可控的铁代谢干预的策略和方法是提高临床抗HCC治疗水平的有效途径。掌握铁代谢的关键环节是寻找低毒、高效、可控的铁代谢干预策略和方法的关键。铁代谢的“动态平衡”是维持机体生理、应激、病理状态的重要保障,每一次平衡的调整和变化都与机体生物学效应（增殖、损伤、修复、凋亡）密切相关。Labile iron pool（LIP）也被称为“可交换”、“可调节”或“可螯合”的铁池,包含Fe²⁺和Fe³⁺形式,其含量仅占细胞总铁含量的2%-5%,其中Fe²⁺形式含量占绝大多数,此类铁具有与金属螯合物结合的特性,且微量的升高导致细胞超氧化物的局部区域化剧增,而此类超氧化物仅被机体GSSH/GPX抗氧系统所调节和消耗,LIP是胞内外铁的转运、胞内铁储备和降解、胞内铁聚集和分布等铁代谢活动的关键。LIP在铁代谢平衡中的“中枢调节”作用和肿瘤细胞中异常高的LIP含量特征,提示了基于“LIP为靶点的调控策略”可能是实现低毒、高效、可控的铁代谢调控抗肿瘤的关键,但目前仍缺乏成熟可靠的方法和策略。青蒿素及其衍生物是抗疟疾良药,其安全性已被我国数千年的用药史所证实。近年发现青蒿素类药物具有广泛的抗肿瘤作用,既往研究认为是青蒿类化合物倍半萜结构双氧桥键与肿瘤细胞内高含量的铁反应,诱导过量ROS导致杀伤是青蒿类化合物特异性抗肿瘤的一般认识,结合肿瘤胞内高LIP含量和青蒿素类化合物的安全性,这为我们开展靶向LIP的抗肝癌研究的药物筛选提供了重要的线索。虽然青蒿素及其衍生物抗肿瘤作用与铁的关系被相继报道,但是青蒿及其衍生物与铁的具体关系,如青蒿及其衍生物是否直接参与铁代谢、如何参与铁代谢、青蒿及其衍生物与LIP以及ROS三者之间的关系如何,这些问题仍未得到解决,仍需要深入的探讨。本研究从这些问题出发,开展水溶性较好的青蒿素类药物青蒿琥酯（Artesunate,ART）对于HCC细胞杀伤作用以及与LIP的关系研究,以探讨ART调节铁代谢的关键LIP发挥抗HCC细胞的作用及机制,为ART在抗HCC临床应用提供参考和思路。研究方法与结果1.青蒿琥酯对HCC细胞的杀伤作用与胞内labile iron的关系1.1 ART对不同HCC细胞的体内外杀伤效应评估CCK-8检测发现,ART对正常的人胎肝细胞LO2的抑制作用显著低于其它4种p53差异表达的HCC细胞系细胞;ART对HCC细胞的生长抑制作用呈时间和剂量依赖性,具体表现为随着ART作用时间和剂量的增加,抑制效果明显增加。克隆形成实验显示,ART明显抑制HCC细胞自我更新和增殖的能力,且随着ART作用时间的增加,克隆形成抑制效果越明显。FCM检测发现,ART明显诱导HCC细胞周期停滞和死亡的发生。Western blot显示,p53表达状态不同的细胞在ART作用后,p53蛋白的变化与生长抑制、凋亡、周期变化并无一致性,提示p53在ART杀伤HCC细胞的作用中并不关键。小鼠荷瘤实验评估显示,ART对不同HCC细胞的瘤体生长抑制显著,且对主要器官无组织毒性。1.2 ART对HCC细胞铁代谢的影响Western blot检测显示,ART诱导HCC细胞入胞、出胞以及胞内转运相关的铁代谢蛋白的改变,4种HCC细胞均表现为铁调控元件（IRP1/IRP2）显著增加,入胞铁转运蛋白（TFRC1、DMT1）增加,出胞铁外排蛋白SLC40A1减少,胞内铁转运活动相关蛋白（DMT1、ZIP14）增加。ELISA检测显示,ART并未影响HCC细胞胞内总铁和总二价铁的含量。Western blot检测si RNA干扰敲低HCC细胞的转铁蛋白TFRC1和铁外排调控蛋白Hepcidin表达;流式凋亡检测发现,TFRC1和Hepcidin敲低后,HCC细胞均有不同程度的死亡;敲低TFRC1和Hepcidin的HCC细胞对ART诱导的死亡观察中,仅Hep3B表现出死亡率下降。结果提示,ART诱导HCC细胞铁代谢增加。1.3 ART促进HCC细胞内labile iron pool增加流式凋亡结果显示,200μM去铁敏（Deferoxamine,DFO）预添加显著降低了ART对HCC细胞的死亡诱导;钙黄绿素（Calcien AM,C-AM）流式检测和活性细胞共聚焦显示,ART持续升高HCC细胞的可螯合铁池（Labile Iron Pool,LIP）,而DFO明显螯合HCC细胞中LIP。ART作用HCC细胞24小时后,铁蛋白Ferritin表达显著下调。结果提示,ART杀伤HCC作用与LIP直接相关,ART动员HCC细胞LIP升高的共同途径是细胞内铁存储蛋白Ferritin的降解。2.青蒿琥酯诱导HCC细胞内labile iron的分布特点2.1 ART动员HCC细胞LIP增加与溶酶体功能相关CCK-8结果显示,溶酶体靶向抑制剂巴菲霉素A1（bafilomycin A1,baf A1）预添加后,baf A1逆转ART对HCC细胞的生长抑制作用;活细胞C-AM荧光共聚焦显示,baf A1预添加后,ART降低HCC细胞C-AM荧光的现象被明显逆转。结果提示,溶酶体参与ART诱导的HCC细胞LIP增高。2.2 ART促进HCC细胞Ferritin非自噬依赖降解Western blot结果显示,ART诱导Ferritin降解呈剂量依赖性;Baf A1预处理4小时后,ART诱导的Ferritin蛋白降解显著减少。但自噬标志物LC3I/II的变化提示在溶酶体功能抑制的情况下,ART仍可增强SMMC7721和Hep G2细胞自噬流。结果提示,ART促进HCC细胞Ferritin的降解是非自噬依赖的方式。2.3 ART促进HCC细胞溶酶体酸化溶酶体p H检测显示,ART作用HCC细胞4小时后,SMMC7721、Hep3B、Huh7细胞的溶酶体p H值开始下调;Hep G2细胞的溶酶体p H值在8小时开始下降;ART持续作用HCC细胞48小时的整体观察发现,ART显著降低了HCC细胞的溶酶体p H值。溶酶体酸性指示探针lysotracker Red共聚焦显示,baf A1明显阻止ART诱导肝癌细胞的溶酶体酸化。结果提示,ART引起HCC细胞溶酶体酸化,促进Ferritin降解进而增加LIP的含量。2.4 ART动员labile iron在胞内的分布特点活细胞共聚焦观察发现,ART明显增加HCC细胞内labile iron探针ferro Orange荧光强度;labile iron、内质网、溶酶体探针共定位显示,ART增加了内质网和溶酶体labile iron,其中内质网中labile iron探针信号显著增强;线粒体labile iron探针Mito-ferro Green在ART作用后也显著增强。结果提示,ART显著增加HCC细胞内labile iron,且引起labile iron在HCC细胞的亚细胞水平重分布,显著蓄积于内质网和线粒体。3.青蒿琥酯诱导内质网labile iron蓄积杀伤HCC细胞的作用及机制3.1 ART动员labile iron诱导HCC细胞产生致死性ROS活体共聚焦结果显示,ART明显促进HCC细胞脂质过氧化lipid peroxidation（LPO）发生,DFO可逆转此作用;同时CCK-8和流式凋亡检测结果显示,铁死亡脂质过氧化抑制剂（Ferrostatin-1和Liproxstatin-1）未能有效地抑制ART对HCC细胞的生长抑制和死亡,仅DFO明显逆转了ART诱导的生长抑制和死亡。Western blot结果显示,ART诱导抗铁死亡关键蛋白GPX4和SLC7A11增加。CCK-8、流式凋亡、Western blot检测发现,凋亡相关蛋白PARP和Caspase-3均有变化,但Caspase激酶抑制剂Z-VAD-FMK未能明显逆转ART对HCC细胞的杀伤作用,与Caspase激酶依赖的凋亡蛋白的变化并不相符。结果提示,ART诱导HCC细胞死亡不具有典型铁死亡和Caspase依赖的凋亡特征。流式检测发现,ART明显增高HCC细胞ROS产生,ART诱导HCC细胞总ROS和线粒体ROS（Mito SOX）持续增高,DFO预处理后ART诱导的总ROS和线粒体ROS（Mito SOX）明显下降。流式凋亡结果显示,广泛ROS清除剂N-acetylcysteine（NAC）明显降低了ART诱导HCC细胞死亡,而线粒体ROS清除剂Mitoquinone（Mito Q）对ART诱导HCC细胞死亡并没有逆转作用。结果提示,labile iron诱导HCC细胞致死性ROS产生,但线粒体来源ROS不包含其中。3.2内质网蓄积labile iron诱导HCC细胞的致死性ROS线粒体膜电位指示剂TMRM流式检测显示,ART降低了Hep3B、SMMC7721以及Huh7细胞的TMRM荧光,升高了Hep G2细胞的TMRM荧光,DFO预添加均升高HCC细胞的TMRM。共聚焦观察线粒体形态发现,ART明显减少HCC细胞线粒体数量,DFO预添加均逆转ART诱导的线粒体减少。Western blot检测发现,ART并没有引起线粒体凋亡通路相关蛋白Caspase-9的活化。结果提示,labile iron在线粒体累积触发的ROS对ART诱导HCC细胞死亡作用不是直接或关键的。结合不同细胞器的定位染料和活细胞ROS探针共聚焦观察,ART诱导HCC细胞产生的致死性ROS主要集聚于内质网,而DFO预添加降低了内质网致死性ROS的堆积。结果提示,内质网蓄积的labile iron诱导了HCC细胞致死性ROS的产生。3.3 ART触发的内质网氧化压力对HCC细胞死亡的影响Western blot和CCK-8检测发现,ART诱导HCC细胞发生了持续的内质网应激（ER stress）,但内质网应激抑制剂4-phenylbutyrate（4-PBA）并未能有效逆转ART对HCC细胞的毒性。活细胞共聚焦观察脂质过氧化物（lipid peroxidation,LPO）探针liperfluo和内质网探针ER-tracker共定位的发现,ART诱导HCC细胞内质网LPO的堆积,DFO预添加减少了LPO的产生。活细胞共聚焦观察内质网形态变化发现,ART作用HCC细胞24小时后,内质网的致密度明显降低,且ER-tracker荧光明显减弱,而DFO明显逆转了ART引起的内质网形态改变。结果提示,内质网高的氧化压力和labile iron蓄积的产物LPO,导致内质网过载进而引起膜损伤导致HCC细胞死亡。研究结论1.体内外实验证明,ART选择性杀伤HCC细胞,明确了ART杀伤HCC细胞的安全性和有效性;而p53在ART杀伤HCC细胞中非关键作用,同时提示了ART杀伤HCC细胞的普适性。2.ART通过酸化溶酶体促进胞内Ferritin的降解,增高了HCC细胞内LIP水平;LIP直接参与ART杀伤HCC细胞,明确ART靶向调控HCC细胞铁代谢关键LIP的能力。3.ART动员HCC细胞labile iron在内质网的蓄积,并诱导了内质网源性的致死性ROS和内质网膜脂质过氧化的蓄积,破坏了内质网膜的完整性。4.ART诱导HCC细胞labile iron依赖的死亡方式有别于经典的铁死亡和Caspase激酶依赖的凋亡,此死亡方式具有内质网膜的脂质过氧化和内质网结构损伤的特点。从研究结果来看,ART杀伤HCC细胞具有安全﹑普适﹑靶向调节胞内铁代谢关键LIP的价值,加深了我们对于青蒿素类药物与铁代谢关系的抗肿瘤机制的理解和认识。ART诱导labile iron和ROS在胞内膜结构丰富的ER上形成的蓄积,诱导了内质网膜脂质过氧化,最终造成内质网致死性损伤,提示了内质网作为ART杀伤HCC细胞靶点的重要价值。