论文部分内容阅读
研究背景目前,非小细胞肺癌铂类耐药仍然是造成大部分非小细胞肺癌患者疗效差的的主要原因,然而非小细胞肺癌铂类耐药的具体机制尚未完全明了。铂类耐药是由多种因素造成的,其中外泌体和免疫调控介导的耐药可能发挥重要作用。首先,外泌体是细胞分泌的携带生物活性物质的纳米级囊泡,根据前期研究基础,我们提出外泌体可能通过其携带的碱基切除修复关键基因APE1或某些micro RNA传递耐药性。其次,位于肿瘤细胞上的免疫检查点关键分子程序性细胞死亡受体配体1（PD-L1）和程序性细胞死亡受体（PD-1）结合可以抑制免疫反应,而机体的免疫状态与化疗疗效密切相关,由此我们推测,PD-L1单核苷酸多态性也可能对铂类化疗疗效产生影响。本研究将从以上两个层面对非小细胞肺癌铂类耐药机制进行探索研究,为综合评估非小细胞肺癌患者铂类化疗的有效性,采取相应措施改善治疗效果和预后提供理论依据。研究方法1.采用高速离心和外泌体提取试剂盒收集外泌体。用PKH26对外泌体染色后,激光共聚焦观察其进入细胞内的情况。将带GST标签的APE1纯化蛋白（GST-APE1）与A549细胞共同孵育后,观察细胞内GST-APE1的定位情况。采用CCK-8实验和流式细胞术检测不同处理组细胞在不同浓度顺铂下的存活能力和凋亡率。采用Transwell实验评估细胞侵袭和迁移能力。采用APE1的功能抑制剂处理与不同分组外泌体共同孵育后的A549细胞,观察处理后A549细胞在顺铂中的存活率以及-H2AX蛋白变化情况。选取接受铂类化疗方案治疗的NSCLC患者共136例,对血浆外泌体进行提取和鉴定。采用Western blot和ELISA法检测血浆外泌体APE1表达,采用免疫组化检测组织APE1表达。根据实体肿瘤疗效评价标准,分为铂类化疗应答组（CR+PR）和铂类化疗无应答组（SD+PD）,观察APE1表达水平与患者治疗敏感性的关系。2.采用micro RNA芯片检测顺铂（CDDP）处理后外泌体micro RNA的变化情况。采用mi R-1273a mimic、inhibitor或阴性对照转染A549细胞以构建不同mi R-1273a表达水平的细胞。用CCK-8实验和流式细胞术凋亡分析检测不同表达水平的mi R-1273a对细胞在顺铂中存活能力和凋亡率的影响。将A549细胞与高表达mi R-1273a的外泌体共同孵育,研究高表达mi R-1273a外泌体对细胞在顺铂中存活能力的影响。通过生物信息学方法预测mi R-1273a的靶基因,并用Western blot和q PCR进行验证。选择行铂类化疗方案的非小细胞肺癌患者共85例（其中36例用于国际合作研究）,用于临床疗效评价。RT-q PCR用于检测血浆外泌体micro RNA水平;ELSIA用于检测血浆SDCBP或APE1水平。3.收集281例行铂类化疗方案治疗的非小细胞肺癌患者的血液样本,并提取DNA。251名同期接受健康体检的志愿者作为对照组。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术进行基因型分型。用卡方检验比较不同分组个体的基因型分布情况。用Kaplan-Meier分析和Cox单因素和多因素生存分析评价不同基因型患者的预后情况。研究结果1.成功收集到NSCLC源性外泌体,PKH26染色后可观察到着色的外泌体进入受体细胞内。A549细胞与外泌体共同孵育后,细胞对顺铂的敏感性下降,凋亡率降低,同时细胞的增殖、迁移和侵袭能力都有所增强。顺铂处理A549细胞后,细胞和外泌体内的APE1表达增高。与高表达APE1的外泌体共同孵育后,细胞对顺铂的敏感性下降,凋亡率降低,细胞的增殖、迁移和侵袭能力都有所增强。APE1的碱基切除修复功能在外泌体APE1介导的细胞对顺铂敏感性变化中发挥主要作用。在临床样本中,外泌体中的APE1是外周血中APE1存在的主要方式。与健康对照者相比,非小细胞肺癌患者外泌体APE1高表达。对铂类化疗无应答组的患者血浆外泌体APE1的水平明显高于对铂类化疗应答组的患者。2.基因芯片结果显示,与对照组相比,共有276个mi RNAs在顺铂刺激下产生的外泌体(EXOCDDP)中变化>2倍,其中mi R-1273a在这些mi RNAs中的表达差异最为显著。过表达mi R-1273a增强了A549细胞对顺铂的敏感性,外泌体传递mi R-1273a同样可以增强受体细胞对顺铂的敏感性。SDCBP（Syndecan binding protein）可能是mi R-1273a发挥作用的靶点之一。对铂类化疗无应答组的患者血浆外泌体mi R-1273a的水平明显低于对铂类化疗应答组的患者。合作项目结果显示,敲低A549细胞APE1后,外泌体中61个mi RNAs发生显著性变化,其中mi R-130b和mi R-200c的变化可能与NSCLC铂类化疗的疗效有关。3.对9个常见位点的PD-L1 SNP进行检测后,发现PD-L1 rs7866740在非小细胞肺癌患者中G等位基因频率明显高于对照组G等位基因频率（P=0.001）。携带G等位基因的个体患NSCLC的风险显著高于携带C等位基因的个体（OR=3.532,95%CI=1.232-10.129）。Kaplan-Meier分析表明,PD-L1 rs2890658 CA+AA基因型的PFS和OS明显低于CC型（P<0.05）;PD-L1 rs822336 GC+CC的OS明显低于GG型（P<0.05）。Cox生存分析显示,携带PD-L1 rs2890658 CA+AA基因型的患者化疗疗效和预后较差（PFS:校正后HR=1.367,95%CI=1.0-1.8,P=0.038;OS:校正后HR=1.402,95%CI=1.0-1.9,P=0.026）。携带PD-L1 rs822336 GC+CC基因型的患者预后较差（校正后HR=1.393,95%CI=1.1-1.8,P=0.021）,但与疗效无显著相关性。研究结论1.铂类药物刺激下NSCLC外泌体APE1增高,高表达APE1的外泌体可以降低受体细胞对铂类药物的敏感性。2.APE1的碱基切除修复功能可能在外泌体APE1介导的铂类化疗耐药中发挥关键作用。3.非小细胞肺癌患者血浆外泌体APE1水平与非小细胞肺癌铂类化疗疗效相关。4.外泌体mi R-1273a的下降与受体细胞铂类敏感性下降有关。5.非小细胞肺癌患者血浆外泌体mi R-1273a水平与铂类化疗的疗效有关。6.APE1可能通过调控外泌体mi R-130b和mi R-200c水平促进NSCLC铂类耐药。7.PD-L1基因的rs7866740位点与NSCLC易感性有关。PD-L1基因的rs2890658和rs822336位点与NSCLC的预后有关。