【摘 要】
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本课题通过对人IL-4基因的优化并选用高效表达载体，比较重组蛋白rhIL-4包涵体表达、分泌型表达和可溶胞内表达，筛选并获得了高水平的表达菌株；通过控制发酵条件，达到了较高的rhIL
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本课题通过对人IL-4基因的优化并选用高效表达载体，比较重组蛋白rhIL-4包涵体表达、分泌型表达和可溶胞内表达，筛选并获得了高水平的表达菌株；通过控制发酵条件，达到了较高的rhIL-4表达率；在此基础上对包涵体形式表达的rhIL-4纯化方法进行了大量的摸索和研究，建立了较佳的纯化路线，得到了高纯度、高得率的rhIL-4蛋白。
1.IL-4基因的优化设计以及大肠杆菌表达根据大肠杆菌密码子偏爱性优化并合成人白细胞介素4基因。构建了三种表达菌株，分别是包涵体表达型BL21(DE3)/pET30a(+)/rhIL-4，分泌表达型TOP10/pBAD/gIII/rhIL-4和可溶胞内表达型TOP10/pBAD/rhIL-4，比较并筛选高效稳定表达菌株，最终选择以表达水平较高且表达稳定的包涵体表达型菌株BL21(DE3)/pET30a(+)/rhIL-4作为工程菌。
2.工程菌的发酵培养通过优化发酵培养基、控制诱导OD<,600>、诱导时间等发酵条件，5L发酵罐培养工程菌，发酵液OD<,600>为5.0时诱导3.5h收集菌体，最终菌体密度OD<,600>达11.16，目的蛋白表达量占菌体总蛋白的40％以上，单位体积重组蛋白的表达量达200mg/L发酵液。
3.重组蛋白的规模纯化和鉴定建立了对包涵体形式表达的rhIL-4纯化方法。收集的菌体经压榨破菌获得包涵体，通过包涵体变性、层析、透析复性等方法对rhIL-4进行纯化。每升发酵液可获得40 mg重组蛋白，纯度大于98％，回收率为20％以上。N端氨基酸序列测定结果与理论一致；免疫印迹法检测诱导表达的重组蛋白和纯化的蛋白为IL-4。
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