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目的:1.探究miR-34a/STAT3/IL-6R反馈环与免疫检查点PD-L1在食管癌中的相关性2.基于miR-34a/STAT3/IL-6R反馈环,探讨六君子汤调节食管癌EC109细胞PD-L1的机制3.基于泛素-蛋白酶体途径探讨六君子汤抑制PD-L1蛋白降解的机制方法:1.选取人食管癌EC9706、EC-1、TE-1、EC109细胞,采用荧光定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction,q PCR）技术和免疫印迹法（Western blot,Wb）从中筛选高表达PD-L1的食管癌细胞株。2.证实在食管癌细胞中miR-34a/STAT3/IL-6R反馈环与PD-L1表达的相关性,以及六君子汤在此过程中发挥何种作用双荧光素酶报告基因检测在食管癌EC109细胞中miR-34a与PD-L1的靶向关系;MTT比色法筛选miR-34a/STAT3/IL-6R反馈环通路抑制剂（C188-9）、激动剂（人IL-6重组蛋白）以及中药六君子汤的适宜浓度;将细胞随机分为miR-34a模拟物组（miR-34a mimics）、miR-34a抑制物组（miR-34a inhibitors）、阴性对照组（NC、单链NC）、空白对照组、通路抑制剂组（C188-9）、通路激动剂组（人IL-6重组蛋白）、六君子汤低浓度组、六君子汤高浓度组,酶联免疫吸附测定（ELISA）检测各实验组IL-6R含量;q PCR技术检测各实验组miR-34a、STAT3、IL-6R、PD-L1等m RNA的表达情况;Western blot法检测各实验组STAT3、pSTAT3、PD-L1等蛋白表达差异。3.以细胞周期抑制剂帕博西尼及泛素-蛋白酶体抑制剂MG132为阳性对照,检测六君子汤对食管癌细胞周期以及泛素-蛋白酶体途径的影响MTT比色法筛选细胞周期抑制剂（Palbociclib）的适宜浓度;将细胞随机分为空白对照组、泛素-蛋白酶体抑制剂组（MG132）、细胞周期抑制剂帕博西尼低浓度组（CKI-L）、细胞周期抑制剂帕博西尼高浓度组（CKI-H）、六君子汤低浓度组、六君子汤高浓度组,流式细胞术检测各实验组细胞周期分布情况;q PCR技术检测各实验组细胞周期相关基因CDK4、CDK6、cyclin D1、Rb及PD-L1等m RNA的表达情况;Western blot法检测各实验组CDK4、CDK6、cyclin D1、p-Rb、Ubiquitin、PD-L1等蛋白表达差异。结果:1.人食管癌EC9706、EC-1、TE-1、EC109细胞相比较,EC109细胞为高表达PD-L1细胞株（P＜0.01）。2.miR-34a/STAT3/IL-6R反馈环调节食管癌EC109细胞PD-L1的表达双荧光素酶报告基因显示:转染miR-34a mimics能有效抑制野生型PD-L1的荧光素酶活性（P＜0.05）,转染miR-34a inhibitors后荧光值恢复上升（P＜0.01）,提示PD-L1为miR-34a的靶基因。应用通路激动剂人IL-6重组蛋白（r IL-6）和miR-34a inhibitors后,IL-6R含量有所增高,但差异没有统计学意（P＞0.05）,其m RNA表达降低（P＜0.01）;STAT3、p-STAT3、PD-L1的表达均显著增多（P＜0.05）;miR-34a表达降低（P＜0.01）。应用通路抑制剂C188-9、miR-34a mimics后,miR-34a表达量显著增高（P＜0.01）,miR-34a过表达抑制了其靶基因PD-L1、IL-6R m RNA及蛋白的表达,且STAT3及其磷酸化水平也降低（P＜0.01）;C188-9组PD-L1的蛋白表达增高（P＜0.01）。3.六君子汤通过调节miR-34a/STAT3/IL-6R反馈环降低PD-L1 m RNA的表达六君子汤低、高浓度组（LJZD-L、LJZD-H）均显著增加了miR-34a的表达（P＜0.01）,使PD-L1、IL-6R、STAT3 m RNA的表达均降低（P＜0.05）;对miR-34a的功能进行抑制后应用六君子汤,miR-34a的表达降低（P＜0.01）,PD-L1（P＜0.01）、IL-6R（P＜0.05）m RNA的表达则恢复升高。提示六君子汤对miR-34a/STAT3/IL-6R反馈环相关指标m RNA的影响可能与增高miR-34a的表达有关。Western blot结果显示:六君子汤低、高浓度组p-STAT3、STAT3的蛋白表达均显著降低（P＜0.01）,PD-L1的蛋白表达均显著升高（P＜0.01）。4.六君子汤干预细胞周期抑制PD-L1蛋白经泛素-蛋白酶体途径降解与阳性对照帕博西尼的结果一致,六君子汤组和C188-9组G1期的细胞比例均显著增多（P＜0.01）,处于G2期的细胞比例均显著降低（P＜0.05）,处于S期的细胞比例有下降趋势,提示其可将EC109细胞周期阻滞于G1/S期。此外,二者对细胞周期通路相关指标如CDK4、CDK6、cyclin D1及其底物Rb等的表达均具有不同程度的抑制作用;对泛素-蛋白酶体途径相关指标如泛素化蛋白水平U biquitin,C188-9组具有抑制作用（P＜0.01）,提示C188-9抑制泛素化蛋白识别PD-L1,造成PD-L1蛋白降解受阻;六君子汤、帕博西尼、MG132则对泛素化蛋白水平Ubiquitin具有促进作用（P＜0.01）,提示六君子汤通过抑制蛋白酶体的功能,促使泛素化的PD-L1在胞内堆积抑制蛋白降解发挥了类似于帕博西尼和MG132的作用。结论:1.在食管癌EC109细胞中,miR-34a/STAT3/IL-6R反馈环与免疫逃逸密切相关,抑制该反馈环的激活可降低PD-L1的表达。2.六君子汤可通过调节miR-34a/STAT3/IL-6R反馈环,逆转IL-6R/STAT3信号通路介导的miR-34a抑制,降低PD-L1 m RNA的表达。3.六君子汤可干预泛素-蛋白酶体途径,促进PD-L1泛素化并抑制蛋白酶体降解,从而促进PD-L1表达,其机制可能与阻滞细胞周期有关。