【摘 要】
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棉蚜（Aphis gossypii）是一种重要的多食性农业害虫,主要通过直接摄取以及间接诱导有害植物病毒对农作物造成损害,导致农作物产量和质量严重损失。棉蚜主要依靠化学农药防治,但由于杀虫剂的过度使用,不仅导致棉蚜等多食性昆虫的抗药性增强,并且对环境和食品安全造成的危害性也日益严重。昆虫P450酶在许多昆虫的生长发育中不可或缺,并且在昆虫适应环境过程中发挥着重要作用,也是作为代谢异生素（杀虫剂,植
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棉蚜（Aphis gossypii）是一种重要的多食性农业害虫,主要通过直接摄取以及间接诱导有害植物病毒对农作物造成损害,导致农作物产量和质量严重损失。棉蚜主要依靠化学农药防治,但由于杀虫剂的过度使用,不仅导致棉蚜等多食性昆虫的抗药性增强,并且对环境和食品安全造成的危害性也日益严重。昆虫P450酶在许多昆虫的生长发育中不可或缺,并且在昆虫适应环境过程中发挥着重要作用,也是作为代谢异生素（杀虫剂,植物毒素）和调节内源性化合物（脂肪酸,激素）的主要解毒酶,在昆虫对杀虫剂的代谢中发挥重要作用。RNA干扰（RNA Interference,RNAi）技术,是一种转录后调控机制,是功能基因组学的有力工具,利用昆虫靶基因的双链RNA（dsRNA）来防御害虫侵害,在昆虫防治研究中开辟了很大的应用潜力。本研究中,对不同地区和不同龄期棉蚜体内P450 CYP6CY3基因的表达规律进行研究。通过棉蚜CYP6CY3基因合成三个干扰片段,利用MEGA script RNAi试剂盒体外人工合成CYP6CY3三个干扰片段（P1/P2/P3）dsRNA,在棉蚜营养液中检测其稳定性。将人工合成的棉蚜dsRNA添加到营养液中饲喂四龄棉蚜,通过观察棉蚜的死亡率检测其对棉蚜存活率的影响,通过q RT-PCR检测dsRNA人工饲喂后CYP6CY3基因相对表达量和利用免疫组化检测棉蚜体内CYP6CY3蛋白水平的变化;通过植物表达载体在拟南芥中表达棉蚜CYP6CY3基因的dsRNA,分别为ds（P1,P2,P3）。主要研究内容如下:1)不同地区和不同龄期棉蚜CYP6CY3基因的表达量分析本研究通过荧光定量检测从不同地区采集回来的棉蚜种群体内CYP6CY3基因的表达规律,对六个地区棉蚜种群CYP6CY3基因的表达量进行分析,其中伊犁地区棉蚜CYP6CY3基因的表达量显著高于实验室饲养的安宁区棉蚜种群（3.30倍）其次是沙湾（2.14倍）,吐鲁番地区（1.12倍）,博乐地区（0.76倍）,库尔勒地区（0.49倍）;通过荧光定量检测棉蚜在不同生长阶段CYP6CY3基因的表达量,结果显示棉蚜在四个龄期和翅蚜阶段,随着龄期的变大基因表达量也随之增大,四龄棉蚜体内表达量显著高于四龄以下的若虫和翅蚜。2)棉蚜CYP6CY3 dsRNA的人工合成及沉默效果的鉴定本研究首先利用人工饲喂的方式,在棉蚜复合营养液中添加终浓度为100ng/μL的CYP6CY3基因三个不同干扰片段的dsRNA,分别为ds（P1,P2,P3）。通过观察棉蚜死亡率和检测CYP6CY3基因沉默情况,选择最佳干扰片段和干扰时间。实验结果显示在人工饲喂棉蚜的情况下,用CYP6CY3基因的dsRNA饲喂棉蚜48 h和72 h后可以观察到棉蚜死亡率逐渐增多,其中P2片段dsRNA饲喂棉蚜72 h后棉蚜死亡率59.62%,显著高于对照组和饲喂的P1﹑P3片段dsRNA。荧光定量结果也显示饲喂48 h和72 h后靶基因沉默水平逐渐增强,饲喂48h时观察到靶基因与对照组相比沉默水平为34.44%,饲喂到72 h时沉默水平达到54.42%。利用免疫组化进一步鉴定饲喂P2片段dsRNA 48 h和72 h后棉蚜靶基因蛋白水平的表达逐渐减少。3)转CYP6CY3 hp DNA 2P1/2P2/2P3基因拟南芥的获得和鉴定本课题组在前期构建获得了能够形成茎环结构的植物表达载体p CAMBIA2300-2P1/2P2/2P3,并利用花序浸染法转化到根瘤农杆菌EHA105中。通过花序浸染法转化到野生型拟南芥,已完成转CYP6CY3 hp DNA 2P1/2P2基因拟南芥T1代拟南芥植株的筛选。但CYP6CY3 hp DNA 2P3基因拟南芥未转化成功,因此本研究迫切需要继续筛选获得转CYP6CY3 hp DNA 2P1/2P2基因拟南芥T2代阳性苗及鉴定,另外需要CYP6CY3 hp DNA 2P3基因拟南芥的遗传转化。本研究成功筛选获得T2代转CYP6CY3 hp DNA 2P1/2P2/2P3基因拟南芥阳性苗并初步鉴定成功。每个片段转基因拟南芥挑选两个株系,利用基因组PCR初步筛选鉴定后,Southern blot进一步鉴定在拟南芥基因组中目的基因的整合情况,结果显示三个干扰片段都整合到拟南芥基因组中。
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