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猪流感病毒（Swine influenza virus,SIV）属正黏病毒科,流感病毒属,该病毒引发的猪流感（Swine influenza,SI）是一种急性呼吸系统传染病,传染性极强,并且常与猪的其他传染病并发,增加死亡率。本研究是在实验室前期利用猪肾细胞（PK-15）CRISPR/Cas9全基因组敲除文库（PK-15-Ge CKO）筛选到猪流感病毒复制相关的宿主基因的前提下,在部分候选基因中寻找对SIV生命周期影响较大的基因,深入研究该基因与SIV复制的关系。本研究利用CRISPR/Cas9技术针对每个候选基因设计3对sg RNA,并构建到质粒Lenti-sg RNA-EGFP上,通过慢病毒包装感染稳定表达Cas9蛋白的PK-15细胞系,构建单基因敲低细胞系,通过TCID50和细胞存活量检测基因敲低后对SIV复制的影响,最终筛选到ALG5和SLC35A1两个宿主因子。为了更接近自然感染状态,我们在稳定表达Cas9蛋白的新生猪气管上皮细胞（NPTr）上分别构建了ALG5和SLC35A1的基因敲除细胞系,并深入研究了ALG5和SLC35A1与SIV复制的关系。本研究表明,ALG5和SLC35A1是影响SIV复制过程的重要宿主因子,为研究SIV的复制和致病机制奠定了基础。主要内容如下:1 候选基因在PK-15-Cas9细胞上敲低对SIV复制的影响慢病毒感染PK-15-Cas9细胞之后,通过绿色荧光观察慢病毒感染效率,通过基因组测序验证sg RNA敲除效率,确定候选基因有效的sg RNA,最终得到各个基因的单基因敲低细胞系。将SIV HB毒株分别感染野生型细胞和单基因敲低细胞系,36 h后收取上清测定病毒滴度并计算TCID50,同时,于病毒感染后72 h观察细胞存活量。结果显示,在候选基因中,除了A28外,其它基因在PK-15-Cas9细胞上敲低后对SIV的复制都有不同程度的抑制作用。在病毒感染72 h后,只有ALG5和SLC35A1两个基因敲低后的细胞系有细胞存活,同时,这两个基因敲低后对病毒复制的抑制作用较为明显。因此,选择ALG5和SLC35A1深入研究其影响SIV复制的机制。2 ALG5对SIV复制的影响得到ALG5敲低的PK-15-Cas9细胞系后,采用有限稀释法筛选ALG5基因敲除的单克隆细胞株,选择由单个细胞长成的细胞集落,观察绿色荧光覆盖率。通过Western blot验证了ALG5在PK-15-Cas9细胞上完全敲除,得到了PK-15-Cas9细胞上ALG5敲除细胞系。同时,将ALG5基因克隆到p3×Flag-cmv14载体上。ALG5在PK-15-Cas9细胞上敲除显著抑制SIV的复制,过表达促进SIV的复制。为了更接近自然感染状态,在NPTr-Cas9细胞上构建了ALG5基因敲除细胞系。将sg RNA构建到Lenti Guide-puro载体上,慢病毒感染细胞后用Puromycin筛选阳性细胞并挑取单克隆细胞株,最终得到了NPTr-Cas9细胞上ALG5敲除细胞系。结合TCID50和Western blot验证了ALG5在NPTr-Cas9细胞上敲除显著抑制SIV复制,过表达促进SIV的复制。为了确定基因敲除对细胞活性的影响,通过CCK-8实验验证了基因敲除细胞和野生型细胞的细胞活性无显著差异。SIV感染野生型NPTr-Cas9后,随着病毒的增殖,ALG5的蛋白表达量上调。最后,证实ALG5敲除也可以抑制PR8、H9N2、F26流感毒株的复制,无毒株特异性,其中对H9N2毒株复制的抑制作用最明显。3 SLC35A1对SIV复制的影响通过同样的方法,我们在NPTr-Cas9上构建了SLC35A1敲除的单克隆细胞系,SLC35A1敲除对SIV复制的抑制作用较ALG5更为显著。同时,将SIV感染基因敲除细胞系后72 h,通过细胞计数证实细胞存活比例大于80%。另外,SLC35A1敲除可以抑制PR8、H9N2和F26毒株的复制,无毒株特异性,其中对PR8的抑制作用最明显。为了验证SLC35A1影响SIV复制的阶段,我们通过病毒吸附实验证实了SLC35A1敲除后,SIV在细胞表面的吸附显著受阻,表明SLC35A1在NPTr-Cas9上敲除后通过影响病毒粒子的吸附从而抑制了SIV的增殖。