论文部分内容阅读
背景:舌由颅神经嵴来源的间充质细胞（Cranial Neural Crest derived Cells,CNCCs）和枕部体节来源的肌源性细胞共同发育而成,其中间充质细胞形成舌的肌腱、舌中隔等结缔组织,肌源性细胞形成舌肌。结缔组织与舌肌的发育并非完全独立,二者存在组织间相互作用。蛋白聚糖（Proteoglycans,PGs）是结缔组织细胞外基质中最重要的生物大分子之一,通过附着的糖胺聚糖链（Glycosaminoglycans,GAGs）与多种生长因子、趋化因子及细胞表面受体等相互作用,参与调控细胞粘附、迁移、增殖、分化等过程。Fam20B（Family of Sequence Similarity 20 Member B）可编码合成木糖激酶,对PGs核心蛋白上GAGs的合成至关重要。已有研究证明,Fam20B失活可以导致多种PGs的GAGs（包括硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素）的缺失。本研究中,我们利用Wnt1-Cre;Fam20Bf/f小鼠,观察Fam20B缺失对小鼠舌发育的影响。目的:本课题构建特异性基因敲除小鼠Wnt1-Cre;Fam20Bf/f,即用神经嵴细胞特异性的Wntl-cre条件性敲除Fam20B,以消除神经嵴来源的间充质细胞及其衍生的舌结缔组织内Fam20B表达,旨在探究GAGs在舌结缔组织发育中的作用,及其调控舌结缔组织与肌肉间相互作用的机制。方法:用Wnt1-Cre;Fam20Bf/+小鼠与Fam20Bf/f小鼠杂交以产生Wnt1-Cre;Fam20Bf/f小鼠,分别取Wnt1-Cre;Fam20Bf/f小鼠胚胎和同窝野生型胚胎（WT）,对组织固定、脱水、包埋和切片。通过阿尔新蓝染色观察舌中糖基化差异,拍摄舌大体照及Masson染色确定舌表型,通过免疫组化（Myo D、Myogenin和Myosin）分析舌肌纤维分化情况,并通过Myf5-Cre;Fam20Bf/f小鼠进一步观察舌肌发育状况。提取舌组织RNA,分析舌中结缔组织发育早期及分化成熟阶段特异性标志物m RNA表达水平,Brd U标记的细胞增殖实验/TUNEL法细胞凋亡实验分别比较细胞增殖/凋亡差异。通过E12.5天Wnt1-Cre;Fam20Bf/f;BATGAL小鼠舌整体Lac Z染色,观察舌中Wnt/β-catenin信号的表达情况,并利用特异性激活Wnt经典信号的Wnt1-Cre;Fam20Bf/f;Ctnnb1ex3f小鼠模型进行Masson染色观察小舌畸形是否被挽救。结果:（1）阿尔新蓝染色结果显示,与野生型相比,Wnt1-Cre;Fam20Bf/f小鼠舌间充质中观察到蓝色范围、强度均降低,提示随着Fam20B缺失,舌中GAGs积累明显减少。（2）舌大体照及Masson染色显示,Wnt1-Cre;Fam20Bf/f小鼠表现出小舌畸形,舌系带前端游离部分变短,舌中隔缩窄,肌腱呈退化状态。（3）免疫组化染色显示,与野生型相比,Wnt1-Cre;Fam20Bf/f小鼠成肌决定因子Myo D和分化后期标记物Myogenin的表达均无明显差异,且成熟肌纤维标记物Myosin染色同样未见异常,提示Wnt1-Cre;Fam20Bf/f小鼠舌肌发育未受到影响。E16.5天矢状切面Myosin染色可见,舌前部将横肌分隔成小叶状的结缔组织减少,肌纤维排列紊乱;舌后部上纵肌与直肌呈杂乱交叉状态,说明舌结缔组织发育异常。Myf5-Cre;Fam20Bf/f小鼠Masson染色可见舌发育正常,无小舌畸形,进一步证实Fam20B缺失不影响舌肌发育,仅导致结缔组织发育异常。（4）Real-Time PCR结果显示,Wnt1-Cre;Fam20Bf/f小鼠舌肌腱早期分化标记物Scx和分化成熟标记物Tnmd的m RNA表达水平均显著下降,不规则结缔组织早期特化标记物Tcf4以及舌中Col4的表达在Wnt1-Cre;Fam20Bf/f小鼠舌中明显减少,均提示舌间充质中GAGs含量减少影响舌结缔组织的正常发育,并在舌发育后期进一步导致肌腱退化。（5）Brd U标记结果显示,与野生型相比,Wnt1-Cre;Fam20Bf/f小鼠仅有颏舌肌中隔区域的结缔组织细胞增殖水平下降,其余组织无差异。TUNEL法细胞凋亡实验结果无差异,说明CNCCs中Fam20B缺失抑制舌结缔组织细胞增殖水平,而未影响细胞凋亡。（6）Lac Z染色显示,Wnt1-Cre;Fam20Bf/f;BATGAL小鼠舌间充质区域蓝色明显减少,在舌后部中隔区域减少尤为明显,提示随着Fam20B缺失,Wnt经典信号在Wnt1-Cre;Fam20Bf/f小鼠舌中表达下调。（7）Wnt1-Cre;Fam20Bf/f;Ctnnb1ex3f小鼠Masson染色未见小舌畸形、舌前部游离端变短及舌中隔缩窄,小舌畸形被挽救,提示Fam20B缺失可能通过抑制Wnt经典信号导致舌发育异常。结论:（1）小鼠CNCCs中Fam20B的缺失未影响舌肌发育,可能通过抑制舌结缔组织细胞的增殖影响其正常发育;（2）舌间充质中GAGs含量减少可能通过下调Wnt/β-catenin信号活性导致结缔组织发育异常,最终导致小舌畸形。