乙型肝炎病毒是一种非细胞致病性DNA病毒,在全球,约有3.5亿人口患慢性乙肝。当乙肝病毒侵入机体后,约有10%感染者可演变成慢性感染。而乙肝慢性化又是导致肝硬化和肝癌的主要因素,每年约有100万感染者死于慢性乙型肝炎。因此,对HBV感染患者进行抗病毒及免疫治疗已成为当务之急。慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)肝脏病变主要是由宿主体内HBV感染的肝细胞和免疫分子之间不合适的免疫应答所致。对病毒的细胞免疫应答是一把双刃剑,一方面,强烈的特异性的T细胞反应有助于病毒的清除,另一方面,由于机体在清楚病毒过程中损伤肝细胞,所以若病毒不能被清除,持续的免疫应答会造成肝脏损伤。因此,应用核苷类似物抗病毒过程中病毒载量下降时,机体的免疫应答及免疫功能成为我们关注的重点。人体针对HBV的免疫反应不同,决定了不同的临床类型和转归。阐明HBV感染免疫应答的特点和临床转归的关系,越来越为人们所关注。抗病毒治疗中增强或恢复机体的特异性免疫可能是长期控制HBV感染的基本策略。拉米夫定(lamivudine,LAM)抗病毒过程中免疫应答的特点可能与临床疗效有着密切关系。因此,观察CHB患者免疫应答的特点,了解应用拉米夫定的CHB患者抗病毒过程中临床疗效与免疫应答之间的关系,不仅有助于指导临床抗病毒治疗时机、方案的选择,治疗的效果及预后的判断,而且有助于开辟新的免疫治疗途径。目的:观测CHB患者应用拉米夫定抗病毒前后血清IFNγ(Th1类细胞因子)、IL-4(Th2类细胞因子)水平,和不同临床类型CHB患者外周血CD4+CD25+调节性T淋巴细胞(Tregs)占CD4+T细胞比例的变化,以探讨这些因素和预后及耐药发生的关系。方法:1.ELASA法检测血清IFNγ、IL-4水平:随机选择CHB患者90例,其中男性70例,女性20例,年龄范围30±12.6岁。所有患者均符合以下条件:血清HBsAg阳性、HBeAg阳性、HBV DNA≥105Copies/ml, ALT>80U/L、ALB>30g/L,PLT>100×1012/L;所有CHB患者给予LAM(商品名贺普丁,葛兰素史克公司)100mg,1/日,口服,监测疗程12个月。分别于其治疗前、及服药后3个月、12个月采集静脉血检测血清IFNγ、IL-4水平,定期化验肝功能、乙型肝炎标志物(HBV-M)及HBV DNA。健康对照组20例,其中男性12例,女性8例,年龄21-36岁。2.流式细胞术检测外周血CD4+CD25+Tregs细胞:选择40例患者,其中包括:血清HBeAg阳性CHB患者10人,其中男性6例,女性4例,年龄28±11.6岁;肝功能正常的HBV携带者10例,男性4例,女性6例,年龄33±10.5岁;选择HBeAg阳性CHB患者在口服LAM 100mg,1/日,治疗过程中发生持续应答患者10例,男性5例,女性5例,平均年龄30±10.6岁;HBeAg阳性CHB患者在口服LAM 100mg,1/日,治疗过程中出现反弹(病毒学和生化学同时反弹)患者10例,男性8例,女性2例,平均年龄59±16.5岁;另外选择健康对照组10例,男性5例,女性5例,平均年龄29±6.5岁。采集静脉血检测肝功能、HBV-M、HBV DNA及CD4+CD25+Tregs细胞占CD4+T细胞的百分比。结果:1.随访90例CHB患者,全部为HBeAg阳性患者(检测IFNγ、IL-4水平),拉米夫定治疗1年,完全应答者15例(16.7%),部分应答者47例(52.2%),无应答者28例(31.1%)。治疗3个月内出现部分应答的发生率为37.8%(34/90);治疗1年时持续应答者48例(53.3%);反弹(病毒学和生化学同时反弹)发生率15.5%(14/90),反弹病例来自完全应答的有2例,来自部分应答的有12例。其中,3个月内发生部分应答的占5例,3个月以后发生部分应答的的占7例。2. ELASA法检测血清IFNγ、IL-4水平及IFNγ/IL-4结果:①CHB患者组治疗前, IFNγ、IL-4水平分别为18.83±7.35pg/ml、为25.54±12.56pg/ml ;正常对照组为15.24±3.93pg/ml、13.51±5.86pg/ml,前者高于后者,差异有统计学意义(p<0.05);CHB患者组IFNγ/IL-4比值为0.64±0.28,较正常对照组1.14±0.39降低(p<0.05)(Table 1)。②治疗1年完全应答组、部分应答组及无应答组比较,治疗前IFNγ水平分别为23.65±3.24pg/ml、14.10±2.08pg/ml、8.59±3.14 pg/ml,各组差异均有统计学意义(p<0.05);治疗后IFNγ水平分别为33.74±6.63pg/ml、18.57±3.76pg/ml、8.59±3.14pg/ml,各组差异均有统计学意义(p<0.05);IL-4水平在完全应答组治疗后较治疗前下降,差异有统计学意义(p<0.05);其它两组,治疗前后变化不大,差异无统计学意义(p>0.05) (Table 2);③完全应答组治疗后IFNγ水平升高,IL-4水平下降,IFNγ/IL-4升高1.16±0.51,接近或高于对照组,治疗前后比较差异有统计学意义(p>0.05)。部分应答组IFNγ有所升高,但低于完全应答组,IL-4稍下降,IFNγ/IL-4为0.75±0.53,无应答组IFNγ/IL-4治疗后较治疗前稍上升,部分应答组,无应答组治疗前后IFNγ/IL-4比较均无统计学意义(p>0.05) (Table 2)。④CHB患者治疗后发生反弹组,IFNγ水平治疗前(10.72±3.76) pg/ml,治疗后升高为15.54±7.82pg/ml,差异有统计学意义(p>0.05),治疗前IL-4为19.16±7.63pg/ml,IFNγ/IL-4为0.61±0.19,治疗后IL-4为19.93±8.17pg/ml,IFNγ/IL-4为0.70±0.21,治疗前后比较差异无统计学意义(p>0.05)(Table 2)。⑤CHB患者治疗3个月内出现部分应答组治疗之前IFNγ水平为16.93±5.02pg/ml,高于3个月后出现部分应答者治疗前的IFNγ水平13.72±4.81pg/ml,差异有统计学意义(p<0.05)(Table 3)。3.流式细胞术检测外周血T细胞亚群结果,各组CD4+CD25+Treg细胞亚群比较(Table 5):①CHB组、HBV携带者及健康对照组的外周血的CD4+CD25+Treg细胞占CD4+ T细胞的百分比分别是: HBV携带者组(6.14±0.53)% , CHB组(4.11±0.53) %,健康对照组的(2. 86±0.63) %,差异有统计学意义(P均<0.05);②LAM治疗后持续应答的患者组CD4+CD25+Tregs细胞占CD4+ T细胞的百分比为(2.3±0.41)%,低于未经治疗的CHB患者组,差异有统计学意义(p<0.05);持续应答组和健康对照组比较,差异无统计学意义(p>0.05)。③LAM治疗过程中反弹的患者组CD4+CD25+Tregs细胞占CD4+T细胞的百分比为(4.7±1.26)%,低于HBV携带者组,差异有统计学意义(p<0.05),高于健康对照组和持续应答组,差异有统计学意义(p<0.05),和CHB组比较差异不大(p>0.05),无统计学意义。结论:1.CHB患者IFNγ水平下降,IL-4水平上升,表现为Th2类细胞占优势,Th1/ Th2比例失衡。表明CHB患者体内存在细胞免疫应答的紊乱,这可能是机体不能有效清楚病毒,导致疾病慢性化的一个重要因素。2.CHB患者LAM治疗后,在3个月内出现部分应答的患者组,治疗前IFNγ水平较3个月后出现部分应答组高,表明治疗前患者的免疫功能与抗病毒疗效有着密切关系,免疫功能相对较好者治疗应答程度高。抗病毒治疗前检测患者免疫功能对于制定治疗方案、预测疗效均有重要意义。3.反弹组在治疗前后IFNγ水平较治疗前升高,但仍以Th2类细胞因子应答为主,说明IFNγ在机体抗病毒过程中起着重要的作用,在拉米夫定治疗后,随着病毒载量的下降,细胞免疫功能有所恢复,但是不足以抑制病毒复制,导致病毒学和生化学的反弹。4.CHB患者LAM治疗后完全应答组表现为Th1类细胞因子占优势,Th1/ Th2平衡恢复,而部分应答组及无应答组仍以Th2类细胞因子应答为主,表明LAM治疗的应答程度与治疗后Th1/ Th2平衡的恢复与否有关。5.CHB组外周血CD4+CD25+Tregs细胞的百分率较HBV携带者低,但二者均高于健康对照组。表明在CHB患者体内CD4+CD25+Tregs抑制作用相对减弱,CD8+T细胞的活性相对增强,部分肝细胞发生变性、坏死乃至凋亡,同时HBV得到部分清除。6.CHB患者治疗后持续应答组CD4+CD25+Treg频率基本恢复正常,明显低于未经治疗的CHB和HBV携带者,表明Tregs的存在可能抑制HBV特异性免疫应答,随着病毒载量的下降,体内Tregs的抑制作用减弱。7.LAM治疗中出现反弹的患者组,外周血CD4+CD25+ Tregs频率均较HBV携带者组下降但仍高于持续应答组,说明随着病毒载量下降,机体免疫功能有所恢复,但是部分患者机体尚不能完全控制病毒,这种情况下,随治疗时间延长,病毒在低水平复制很容易出现病毒变异。