【研究背景】失重环境造成骨重塑过程中骨形成与骨吸收活动失衡,引起航天员的承重骨发生持续性的骨质丢失:骨钙平均以每月1%～2%的速率丢失,钙磷代谢失衡,骨量降低,且没有自限性,即使采取综合对抗措施仍不能完全阻止这种现象。因此,失重性骨质丢失已经成为限制人类进行中长期载人航天飞行的主要因素之一。目前我国已经开始建设中、长期有人照料的空间站,进一步阐明失重性骨质丢失的发生机制并提出有效的对抗策略已是我国航天医学领域亟需解决的重大问题,开展相关研究颇为重要。骨骼微血管在骨稳态维持过程中发挥重要作用,血管新生与骨形成之间有紧密的时空联系,被称为“血管新生-骨形成耦联”。研究发现,人类和小鼠在发生骨质疏松时,骨骼微血管的含量显著降低。通过药物干预或者构建转基因小鼠,促进小鼠骨骼微血管新生,则可促进新骨形成与骨折修复。这些结果提示骨骼微血管的减少参与了骨质疏松症的发生,而促进骨骼微血管形成可以改善骨质疏松症。在血管新生与骨形成的耦联过程中,血管内皮细胞发挥着至关重要的作用。血管内皮细胞不仅是血液与血管壁之间的生物屏障,还可以合成和分泌多种血管活性物质,在血管新生过程中发挥着关键的调节功能。然而在失重性骨质丢失发生过程中,骨骼微血管的结构和功能如何改变?是否参与了骨质丢失的发生发展?可能涉及的调控机制是什么?这些问题尚未被系统性地探究和阐明。非编码RNA是近些年来的研究热点,大量研究发现众多非编码RNA分子参与调控多种关键的生物学过程。其中,lncRNA是一类与m RNA结构类似,长度超过200 nt,但没有长ORF的RNA分子。目前,已有文献报道lncRNA能够通过多种方式调控内皮细胞的功能和血管新生过程。但是在模拟失重条件下,微血管内皮细胞中lncRNA的变化及其参与调节微血管内皮细胞功能的研究却鲜有报道。【目的】本课题将“血管新生-骨形成耦联”作为研究切入点,旨在观察失重性骨质丢失发生过程中,骨骼微血管的结构和功能变化特点,探究可能涉及的分子调控机制,以期进一步丰富空间生物学领域失重性骨质丢失发生发展的基础理论,也为其预防和治疗寻找新的干预靶点。【方法】1.构建HLU小鼠模型,micro-CT扫描、H＆E染色、OCN染色评估模拟失重效果。免疫荧光染色标记CD31和Emcn以检测骨骼微血管的含量和结构改变。2.利用2D回转器对小鼠微血管内皮细胞（bEnd.3细胞）进行模拟失重处理,检测bEnd.3细胞在模拟失重条件下的功能改变:CCK8实验检测其增殖活性的变化,western blotting检测PCNA的蛋白表达,流式细胞术检测其细胞周期的变化。3.利用2D回转器对bEnd.3细胞进行模拟失重处理48 h,采用全转录组测序技术筛选差异表达的lncRNAs。通过qRT-PCR验证模拟失重条件下bEnd.3细胞中差异表达的lncRNAs,并在HLU小鼠骨组织切片中进行FISH标记,从而明确候选lncRNA分子。4.采用RACE实验明确lncRNA MUSEL的全长序列,并通过CPAT评估其蛋白编码能力。5.通过在bEnd.3细胞中转染lncRNA MUSEL的过表达质粒和siRNA,检测其对细胞增殖的调控作用。6.bEnd.3细胞中转染lncRNA MUSEL过表达质粒后对其进行回转处理,探讨其过表达是否可以缓解模拟微重力引起的细胞增殖能力减弱。7.RNA FISH和RNA核质分离实验明确lncRNA MUSEL的亚细胞定位。通过生物信息学分析,预测能够与lncRNA MUSEL结合的microRNA。采用荧光素酶报告基因实验和anti-Ago2 RIP实验验证lncRNA MUSEL与miR-148a-3p的靶向结合关系,并进一步探讨lncRNA MUSEL对miR-148a-3p的调控作用。8.利用miR-148a-3p mimic与inhibitor在bEnd.3细胞中调控miR-148a-3p的表达,检测其在正常重力和模拟失重环境下对bEnd.3细胞增殖功能的调控作用。9.通过生物信息学分析和文献回顾,预测miR-148a-3p的靶基因,并使用qRT-PCR及western blotting方法验证其对Met表达的调控作用,并通过miR-148a-3p inhibitor和siRNA-Met双转染实验验证miR-148a-3p是否通过Met调控bEnd.3细胞的增殖功能。10.探讨lncRNA MUSEL与Met之间是否存在调控关系。回转条件下bEnd.3细胞中转染si-Met和lncRNA MUSEL过表达质粒,探讨在模拟失重条件下lncRNA MUSEL是否通过Met发挥促进bEnd.3细胞增殖的作用。【结果】1.HLU小鼠胫骨骨骼微血管含量显著减少。2.bEnd.3细胞在模拟失重条件下增殖功能减弱,并发生细胞周期阻滞。3.模拟失重条件下,bEnd.3细胞的lncRNA表达谱发生明显改变。4.LncRNA MUSEL在模拟失重bEnd.3细胞和HLU小鼠胫骨组织切片中的含量均显著减少。正常重力条件下lncRNA MUSEL可促进bEnd.3细胞增殖,过表达lncRNA MUSEL可缓解模拟失重导致的bEnd.3细胞增殖减弱。5.LncRNA MUSEL主要定位在细胞质,可通过ce RNA机制竞争结合miR-148a-3p,减少其表达。MiR-148a-3p在模拟失重细胞模型中表达显著上调,并且可被lncRNA MUSEL过表达所抑制。6.MiR-148a-3p可抑制bEnd.3细胞增殖。在模拟失重条件下,抑制miR-148a-3p可以改善bEnd.3细胞增殖。在模拟失重条件下过表达miR-148a-3p可减弱lncRNA MUSEL的促增殖作用。7.Met是miR-148a-3p的靶基因。MiR-148a-3p可通过Met调控bEnd.3细胞增殖。8.在正常重力和模拟失重条件下,lncRNA MUSEL可以显著影响Met的蛋白表达水平。模拟失重条件下lncRNA MUSEL可以部分通过Met调控bEnd.3细胞的增殖功能。【结论】1.模拟失重条件下小鼠胫骨骨骼微血管的结构紊乱、含量降低。2.模拟失重条件下bEnd.3细胞增殖功能受到抑制,其lncRNA表达谱发生明显改变。3.重力敏感性lncRNA MUSEL在模拟失重bEnd.3细胞和HLU小鼠骨组织中的表达均显著降低。LncRNA MUSEL具有促bEnd.3细胞增殖作用,过表达lncRNA MUSEL可有效缓解模拟失重导致的bEnd.3细胞增殖减弱,其作用机制为lncRNA MUSEL作为ce RNA竞争性结合miR-148a-3p进而影响Met蛋白表达,从而调控bEnd.3细胞增殖。