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绵羊在养殖业中占有重要地位,但子宫内膜炎的频发却影响着绵羊养殖产业的发展。当前针对绵羊子宫内膜炎的治疗方法主要为抗生素疗法,但抗生素的大量使用会造成耐药细菌的产生,并且抗生素残留会对人类生产和生活造成不良影响。由于中药的价廉易得、副作用小、不易产生耐药性、无休药期等特点,越来越多研究人员将关注点聚焦于中药的探索和研发。因此本文旨在研究一种能用于预防和治疗绵羊子宫内膜炎的中药复方,并探究其活性成分可能的抗炎机制,为临床上防治羊子宫内膜炎提供新的方法和理论基础。1.通过酶消化法和差速消化法分离培养并纯化绵羊子宫内膜上皮细胞,使用间接免疫荧光检测CK18的表达,对细胞类型和纯度进行鉴定;使用不同MOI的大肠杆菌感染绵羊子宫内膜上皮细胞,通过观察细胞形态、检测细胞凋亡水平和炎症相关基因的表达,选择建立子宫内膜炎体外模型的大肠杆菌最佳MOI。结果显示,试验成功分离并纯化了绵羊子宫内膜上皮细胞,CK18的阳性表达率高于95%;与空白对照组相比,当大肠杆菌MOI为1:10时,子宫内膜上皮细胞形态和凋亡比例无明显改变,炎症因子表达水平也无显著变化;大肠杆菌MOI为1:1时,细胞形态无明显变化,仅有少量空泡产生,细胞凋亡水平增加不显著,但炎症因子表达水平显著升高;当MOI大于5:1时,细胞形态变化明显,出现透明化、皱缩甚至脱落,凋亡比例也明显升高,同时炎症因子表达水平显著升高。2.使用半仿生酶法提取自拟中药复方“净宫方”有效成分,通过qPCR、Western Blot和ELISA等技术检测“净宫方”提取物对大肠杆菌诱导的绵羊子宫内膜上皮细胞炎症反应的调控作用。结果显示,“净宫方”提取物无急性毒性,且提取物单独孵育不会诱导细胞发生明显的炎症反应;“净宫方”提取物显著下调了大肠杆菌诱导的绵羊子宫内膜上皮细胞中TLR4/NF-κB信号通路相关基因mRNA和蛋白水平的表达,抑制了炎症因子的分泌。3.通过qPCR、Western Blot、ELISA、IF和YF?488-AnnexinV与PI双染检测黄芪苷和绿原酸对大肠杆菌诱导的子宫内膜上皮细胞炎症反应的调控作用及机制。结果显示,大肠杆菌感染能显著升高绵羊子宫内膜上皮细胞中TLR4/NF-κB信号通路内相关基因mRNA和蛋白的表达水平,诱导NF-κB的磷酸化和核易位,引起细胞凋亡;而黄芪苷和绿原酸预处理,显著下调了子宫内膜上皮细胞TLR4/NF-κB通路中相关基因mRNA和蛋白的表达水平,抑制了NF-κB的磷酸化和核易位以及炎症因子的分泌,降低了凋亡细胞的比例。以上实验结果说明,通过大肠杆菌感染子宫内膜上皮细胞建立的绵羊子宫内膜炎体外模型的大肠杆菌最佳MOI为1:1;自拟中药复方“净宫方”能有效缓解大肠杆菌诱导的绵羊子宫内膜上皮细胞的炎症反应;黄芪苷(100μg/mL)和绿原酸(50μg/mL)能有效抑制大肠杆菌诱导的绵羊子宫内膜上皮细胞的炎症反应,其可能的作用机制为通过下调TLR4的表达,抑制TLR4介导的NF-κB信号通路激活,从而缓解炎症反应的发生。