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本研究旨在建立一种可操作性强且能获得高受精率的鸡精液冷冻保存技术,为利用冷冻精液长期保存珍稀禽类遗传资源、引种等技术提供技术支撑。本文以我国珍稀地方品种黑丝羽乌骨鸡为素材,对鸡精液甘油细管冷冻保存技术的关键步骤进行了优化,主要有稀释液配制、冷冻速率、解冻速率、甘油去除、甘油浓度、输精方法等几个方面。实验结果如下：1不同冷冻稀释液对鸡精液保存效果的影响①选取FEB、BPSE、L、LT四种鸡精液稀释液,用高温高压和过滤灭菌两种方式,按精液与稀释液1：2比例稀释后在5℃保存,观察0-168h内的活力。结果表明：同一稀释液不同灭菌方式的保存效果无显著性差异,保存效果由好到差依次为：BPSE液>LT液>L液>FEB液。②用以上四种稀释液,分别按精液与稀释液1：1和1：10的稀释比例进行稀释打击实验,然后在5℃保存,观察0-168h内的活力。结果表明：同一稀释液不同稀释比例的保存效果之间有显著性差异,不同稀释液保存效果由好到差依次为：LT液>BPSE液>L液>FEB液。综合以上两个实验结果选取LT稀释液作为本实验的冷冻基础液。③抑菌实验结果表明：在稀释液中添加适量双抗,在-20℃保存一段时间后,大肠杆菌仍对抗生素具有高敏感性。2冷冻、解冻速率筛选结果冷冻速率方面,用本实验室专利冷冻装置进行冷冻速率优化实验,结果如下：①一步法冷冻时,将冷冻装置在液氮面冷冻熏蒸时间为3-5min时冷冻效果最佳,解冻活力可达0.7；②二步法冷冻程序时,垫高法(10cm)冷冻程序：第一步冷冻熏蒸3～5min,第二步在液氮表面熏蒸约5min时获得了较好的冷冻效率,解冻精液活力在0.6～0.8之间；③两步法冷冻第一步距离液氮面17cm时的活力显著好于所有其它冷冻速率。即先以-15～-6℃/min的速率熏蒸1-5min,后再以-60～-27℃/min的速率熏蒸1～5min冷冻效果最好,解冻精液活力达到0.8以上。用优化的冷冻程序,6%浓度甘油制作细管冻精,最高获得了77.63%和73.38%的受精率和出苗率。解冻速率方面,不同解冻温度的解冻效果依次为：5℃>10℃>40℃>50℃,解冻效果最佳的解冻温度为5℃,和10℃差异性不显著。3去甘油、不同甘油浓度、不同输精方法的受精率结果①采用分步稀释清洗离心去甘油法,甘油浓度为11%,4组受精率依次为1：2组(61.01%)>1：1组(52.37%)>1：4组(41.48%)>未清洗组(6.29%),1：2组显著高于1：1组(P<0.05),极显著高于1：4组(P<0.01)。未清洗组,未清洗直接离心组极显著低于其它各组(P<0.01)。②采用2、4、6、8、11%五个甘油浓度作为鸡精液冷冻保护剂,不同甘油浓度冻受精率：由高到低依次为6%组(77.63%)>4%组(75.1%)>8%组(70.09%)>11%组(57.43%)>2%组(34.8%)。4%-8%甘油浓度各组的细管冻精受精率之间无显著性差异,但显著高于2%和11%的组(P<0.05)。③采用6%甘油浓度冻精的不同输精方法试验,不同输精量之间的受精率由高到低依次为：0.4mL组(70.15%)>0.2mL(67.08%)组>0.3mL{深阴部输精组(65.51%)>浅阴道输精组(59.33%)}>0.1mL(50.23%)组。输精量为0.1mL组受精率显著低于其它三组,深阴道输精0.3mL组受精率高于浅阴道输精0.3mL组,但无显著性差异。综上所述,本研究用优化的实验参数进行实验：即以LT稀释液为鸡精液冷冻保存的基础液,用两步法冷冻：第一步距离液氮面17cm,先以-14至-9℃/min的速率熏蒸4min,第二步先用15S将细管架缓慢降落到液氮表面,再在液氮面以-60至-25℃/min的速率熏蒸2min冷冻后浸入液氮保存。在5℃解冻3min,采用1：2比例分步稀释清洗去甘油,6%甘油进行深阴道人工输精(0.3m1精液),能够获得77.63%的高受精率。本实验操作简单,稳定性较高,获得了较高的受精率和出苗率,达到了国内外同类研究的先进水平。