一、研究背景作为世界上最常见的恶性肿瘤之一,胃癌严重威胁着人类的生命健康。近年来,虽然在胃癌诊断和治疗方面的研究工作不断取得进步,但进展期胃癌患者仍然预后欠佳。因此,胃癌发生和转移背后的具体机制亟待进一步的阐明。微小RNA(MicroRNA,miRNA)是一种内源性的、通过转录后的调控机制来阻碍蛋白编码基因表达的小分子非编码RNA;通过与蛋白编码基因的信使RNA(mRNA)的3’非翻译区的序列相结合,从而达到阻滞mRNA的翻译或者诱导其降解的作用。据估计,在人类的蛋白编码基因中,约有60%的转录本受到miRNA的转录后调控;而在诸多的肿瘤中,也存在特异性的miRNA或者miRNA家族表达和功能的异常。最近,miR-140-5p在肿瘤中的作用引起了研究者的广泛兴趣。miR-140-5p在结肠癌,胆管癌和下咽癌中均起到肿瘤抑制因子的作用。在胃癌中,有研究报道miR-140-5p在患者血浆中的表达水平明显升高,但另一些研究者却发现在组织标本和胃癌细胞系HGC-27中,miR-140-5p的表达水平却是下调的。更重要的是,miR-140-5p与胃癌患者预后的相关性以及在胃癌发生发展中的作用尚不清楚。值得注意的是,考虑到某单个miRNA分子可能靶向调控多种蛋白编码基因,miR-140-5p如何在胃癌中发挥作用从而改变肿瘤细胞功能表型的潜在机制需要进一步明确。在人类的恶性肿瘤当中,信号通路的紊乱频繁发生,并且对肿瘤的进程产生了巨大影响,而其中就包括一种典型的非受体蛋白激酶,即Src家族蛋白激酶(SFKs)。在诸多人类肿瘤中都存在Src信号的上调,极大的促进了肿瘤TNM分期的进展。YES原癌基因1(YES1),作为可以调节细胞增殖、粘附和分化的关键因子,是SFKs家族非常值得关注的一员。数据表明YES1表达水平降低与多种恶性肿瘤生长能力削弱相关,其中包括恶性间皮瘤,横纹肌肉瘤和胰腺肿瘤,证实了YES1在肿瘤进展过程中所起的核心作用。另外,YES1可诱导部分肿瘤对某些化疗药物产生耐药性。例如,YES1通过促进表皮生长因子受体在细胞核内的转位,诱导非小细胞肺癌细胞株NCI-H226对西妥昔单抗的耐受。然而,目前关于YES1在胃癌中是高表达还是低表达仍然存在争议,Seki等观察到YES1在胃癌组织中相对正常胃组织是高表达的,但Wang等却得到相反的结论;除了相关研究结果的不太一致,YES1在胃癌中表达异常的原因也不清楚。在本研究中,我们评估了miR-140-5p的表达与胃癌患者预后的相关性,并对miR-140-5p是否通过直接靶向YES1来调节肿瘤进程进行了分析。二、材料和方法1选取20对新鲜配对的胃癌组织及癌旁正常组织,采用实时定量PCR检测miR-140-5p的表达水平;随后,在胃癌组织芯片(收录144例胃癌组织以及43例胃良性疾病的正常胃粘膜组织)中采用原位杂交技术进一步检测miR-140-5p的表达情况。2检索Targetscan等数据库,寻找miR-140-5p的潜在靶基因,并使用miR-140-5p mimics或者对照mimics转染胃癌细胞系AGS和BGC823,随后通过western blotting检测细胞中YES1的蛋白水平。采用双荧光素酶报告实验验证miR-140-5p与靶基因的直接联系。3将miR-140-5p mimics转染胃癌细胞,通过MTT、克隆形成、划痕和Transwell实验检测转染miR-140-5p导致细胞功能表型的改变。4构建YES1过表达质粒,并与miR-140-5p mimics共同转染胃癌细胞,再次评估细胞增殖、迁移和侵袭等功能表型的改变。5在BALB/c-nu小鼠(6周左右)的左侧背部皮下注射BGC823细胞,从而建立裸鼠种植瘤的模型。在瘤体内进行内注射治疗后,每三天测量一次肿瘤的体积,每四天对小鼠进行一次称重。在治疗进行的第十九天处死裸鼠,切下瘤体后称重、拍照,随后固定瘤体组织,并进行YES1蛋白的免疫组织化学染色。二、结果1在胃癌组织中miR-140-5p表达水平下调,并与患者的总生存期相关。在20例新鲜配对的胃癌组织以及癌旁正常组织中,我们采用实时定量PCR检测miR-140-5p的表达水平,发现miR-140-5p在肿瘤组织中显著低表达(P<0.001)。随后,对胃癌组织芯片(144例胃癌和43例正常胃组织)进行原位杂交染色,也得出了相类似的结果,即miR-140-5p在32.6%的胃癌组织中染色强度减低,而只有11.6%的正常胃组织显示miR-140-5p表达下调。建立Cox多因素回归分析模型探索miR-140-5p和其他临床参数的预后相关性,结果显示除肿瘤分化程度,浸润深度和淋巴结转移等因素外,miR-140-5p亦可被单独用来预测患者的总生存期,是有利患者预后的保护性因子。进一步的相关性分析说明,miR-140-5p的低表达预示胃癌患者总生存期的缩短,具体的数据是,miR-140-5p低表达患者的中位总生存期为20个月,而高表达者中位总生存期为59个月。2 miR-140-5p直接作用于YES1转录本的3’非翻译区的进化保守序列。通过对Target Scan,miRDB,ComiR等多个数据库进行检索,我们发现YES1可能是miR-140-5p的一个潜在靶基因。为了对数据库预测的结果进行核实,我们选择5株胃癌细胞系和一株非肿瘤的胃上皮细胞,并首先检测了miR-140-5p在这些细胞中的表达情况。然后以miR-140-5p表达量最低的AGS和BGC823细胞作为研究对象,证实了在胃癌细胞中miR-140-5p的表达与YES1蛋白水平的负相关。为了解YES1 mRNA的3’的非翻译区(3’untranslated region,3’UTR)是否是miR-140-5p作用的直接靶点,我们随后进行了双荧光素酶报告实验,即在AGS细胞中共同转入miR-140-5p和含有YES1 3’非翻译区序列的质粒,然后检测细胞的相对荧光值,发现miR-140-5p可以显著降低野生型YES1-3’UTR组的荧光值,却不能导致突变型YES1-3’UTR组荧光值的相对改变。以上结果表明YES1的3’非翻译区是miR-140-5p的一个直接靶点。3在体外实验中miR-140-5p过表达抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。为评估miR-140-5p对胃癌细胞增殖能力的影响,我们采用MTT和克隆形成实验对miR-140-5p转染前后的AGS和BGC823细胞进行检测,发现过表达miR-140-5p可以显著抑制胃癌细胞的增殖活性;克隆形成实验也证实miR-140-5p转染可以显著减弱AGS和BGC-823细胞在平板上形成克隆的能力。随后我们对miR-140-5p转染前后胃癌细胞的迁移和侵袭能力进行评估,发现过表达miR-140-5p极大地降低了肿瘤细胞关闭人工划痕伤口的效率;而侵袭实验也证实miR-140-5p转染导致肿瘤细胞穿透基质胶的能力显著降低。4在miR-140-5p抑制的胃癌细胞中重新表达YES1可以恢复肿瘤细胞的功能表型。为检测miR-140-5p是否通过调控YES1对肿瘤的功能表型产生抑制,我们将构建的YES1过表达载体与miR-140-5p共同转入胃癌细胞。MTT和克隆形成实验说明,在miR-140-5p抑制的胃癌细胞中重新表达YES1可以恢复肿瘤细胞的增殖。与之相类似,划痕和Transwell实验也证实,重新表达YES1亦可以恢复胃癌细胞迁移和侵袭的功能。以上数据表明,miR-140-5p在一定程度上是通过调控YES1对胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭产生抑制。5 miR-140-5p抑制BGC-823种植瘤的生长。在体外实验的基础上,我们进一步研究在体内miR-140-5p的处理能否同样对胃癌细胞产生抑制效果。BGC823细胞被注射到裸鼠的皮下,然后在瘤体内注射miR-140-5p mimics或者对照mimics后进行体积测量。生长曲线提示,与对照组相比,miR-140-5p处理组裸鼠种植瘤的体积显著缩小。随后处死小鼠后对瘤体进行称重,miR-140-5p组瘤体平均重量显著低于对照组。我们通过免疫组化检测瘤体组织YES1的水平,发现与体外实验结果一致,miR-140-5p处理后的肿瘤YES1染色相对对照组明显减弱。三结论miR-140-5p是潜在的胃癌预后相关因子,可以通过直接作用于YES1来抑制肿瘤的进展。我们的研究为胃癌的发病机理提供了新见解,为改进肿瘤的治疗方法提供了新的道路。