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苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californica multiple nuclepolyhedrovirus,AcMNPV）GP41是一种O-糖基化蛋白,定位于病毒粒子的囊膜与核衣壳之间。研究表明gp41是核衣壳出核获取囊膜的必需基因,但具体作用机制尚不清楚。本实验室前期利用酵母双杂交技术从Sf9 cDNA文库中筛查出两个可能与GP41相互作用的蛋白:含卷曲-卷曲-螺旋-卷曲-卷曲-螺旋结构域蛋白2 CHCHD2同源物和甘氨酰-tRNA合成酶GARS同源物。初步确定GP41与CHCHD2和GARS之间的相互作用区段分别位于GP41 AA161-210和AA81-330之间。本文进一步探究GP41与这两种宿主蛋白相互作用的关键氨基酸位点以及GP41与这两种宿主蛋白相互作用对病毒复制的影响。首先,通过免疫共沉淀和双分子荧光互补实验验证GP41与CHCHD2和GARS之间的相互作用。在免疫共沉淀实验中,将HA标签抗体与先后用包含HA标签的chchd2瞬时表达质粒转染和AcMNPV感染的Sf9细胞裂解物混合后,从所获得的免疫沉淀物中分别检测出GP41和HA-CHCHD2。在双分子荧光互补实验中,在表达GP41-黄色荧光蛋白YFP C155的融合蛋白和YFP N173-CHCHD2/GARS融合蛋白的报告病毒感染的Sf9细胞中分别观察到黄色荧光。表达GP41-YFP C155和YFP N173-CHCHD2细胞中黄色荧光分布在细胞核周缘;表达GP41-YFP C155和YFP N173-GARS细胞中黄色荧光主要分布在细胞质中。在GP41AA81-330区间内选取K137、M145、L152、L242和L290五个保守氨基酸密码子进行点突变。酵母双杂交实验结果显示:K137A×CHCHD2和M145A×CHCHD2杂合子在四缺选择培养基平板上只长出个别菌落;L290A×CHCHD2和L290A×GARS平板未长出菌落;K137A×GARS、M145A×GARS、L152A×GARS 和L152A×CHCHD2平板菌落明显减少;L242A×CHCHD2和L242A×GARS平板可见大量菌落。双分子荧光互补实验结果显示表达K137A/M145A-YFP C155融合蛋白和YFP N173-GARS融合蛋白的报告bacmids转染的Sf9细胞中呈现黄色荧光;表达K137A/M145A/L290A-YFP C155融合蛋白和 YFP N173-CHCHD2 融合蛋白的报告bacmids以及表达L290A-YFP C155融合蛋白和YFP N173-GARS融合蛋白的报告bacmid转染的Sf9细胞中未见黄色荧光。这些现象表明K137、M145和L290对GP41与CHCHD2的相互作用,L290对GP41与GARS的相互作用至关重要。这些位点的突变导致GP41与CHCHD2或GARS的相互作用消失。为了检测GP41 K137、M145、L152、L242和L290位点对病毒复制的影响,我们构建了带有polh标签和带egfp标签的AcMNPV gp41突变体用于对Sf9细胞的转染-感染实验。在带polh标签的野生型、gp41缺失-回复突变体以及gp41 L152A和L242A突变体转染的细胞培养皿中绝大多数细胞中可见大量包涵体,而K137A、M145A和L290A突变体转染的细胞培养皿中只有个别细胞可见少量包涵体;用K137A、M145A和L290A转染细胞培养上清感染的细胞中未见包涵体。同样,用带egfp标签的gp41 K137A、M145A和L290A转染细胞培养上清感染的细胞中也未呈现绿色荧光。这些结果表明gp41K137A、M145A和L290A突变体不能产生感染性芽殖病毒体,但能够产生包涵体。为了探究GP41互作蛋白GARS对病毒复制的影响,采用RNAi技术干扰被AcMNPV感染的Sf9细胞gars基因表达,检测干扰对病毒芽殖病毒体增殖的影响。用构建的表达gars反向重复序列的重组病毒感染Sf9细胞,荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,包含gars反向重复序列的重组病毒感染细胞的gars mRNA降低66%。病毒增殖结果显示,在被感染Sf9细胞中重组病毒滴度在所有时间点均低于野生型病毒;在感染后96小时重组病毒达到的峰值水平只有野生型病毒滴度的20%。该项结果表明,AcMNPV病毒复制依赖宿主gars基因的正常表达。上述实验结果表明:（1）AcMNPV GP41与Sf9细胞蛋白CHCHD2和GARS发生相互作用;（2）K137、M145和L290是GP41与CHCHD2相互作用的关键位点,L290是GP41与GARS的相互作用关键位点;（3）GP41与宿主细胞CHCHD2和GARS蛋白的相互作用对于病毒复制至关重要;（4）AcMNPV复制依赖宿主gars基因表达。