论文部分内容阅读
黑色素（Melanin）是一类腐殖质型大分子化合物的泛称，具有复杂的结构，属于非均质的类多酚聚合体，广泛存在于动物、植物和微生物体中。黑色素虽然对于生物的生长和发育并非是必不可少的，但却能提高生物生存竞争的能力。 对羟苯基丙酮酸双加氧酶（4-hydroxyphenylpyruvic acid dioxygenase，4-HPPD，EC1.13.11.27）是酪氨酸代谢过程中的关键酶，催化4-羟苯基丙酮酸（4-hydroxyphenylpyruvate，4-HPP）转变为尿黑酸（Homogentisic acid，HGA）的反应。尿黑酸是植物体内合成质体醌和生育酚（维生素E）的重要前体物质，对4-HPPD的抑制作用可引起植物产生白化现象。HPPD抑制剂作为一种生物安全性好的除草剂，是当前生物农药开发的热点。 本文从大西洋深海沉积物中分离得到一株产黑色素细菌 bIp-2。16S rDNA序列分析表明该菌与施氏假单胞菌（Pseudomonasstutzeri）有最高的序列相似性（同源性99％）。对该菌的生长及产黑色素的特性进行了初步研究，结果表明：bIp-2在对数期后期才开始大量积累黑色素，为典型的次级代谢产物；bIp-2可在4℃～37℃的温度范围下生长，在28℃具有最高的黑色素产量；生长的pH范围偏碱性，在pH7的最适生长条件下黑色素产量最高,同时碱性环境有利于黑色素的快速形成；可以在1%～9%的盐度范围中生长，在5%的盐度下具有最高的黑色素产量。通过PCR扩增获得大小为1087 bp的hppD全长基因并在大肠杆菌中异源表达了该蛋白。Blastx分析发现克隆得到的hppD基因编码的长361 aa的多肽与来自菌株Pseudomonas stutzeri RCH2的4-HPPD蛋白序列具有最高的同源性（97%）。利用以上菌株及其功能基因异源表达的产色素现象尝试构建微生物方法的 HPPD抑制剂筛选手段，使用来自产黑色素菌 bIp-2的 hppD基因异源表达的克隆子的产色素现象，以现有已经商品化的HPPD抑制剂的脱色作用为对照，在96孔板中，对备选化合物进行高通量筛选。使用该方法初步筛选得到7个可能具有对4-HPPD抑制作用的化合物浸膏。与传统的抑制剂筛选手段相比，以微生物的产色素现象为抑制活性指示的方法具有直观快捷、成本低等优点，可以作为快速检验抑制剂作用效果的方法，在HPPD抑制型除草剂的开发中应用。