目的:博莱霉素（Bleomycin,BLM）,是从轮枝链霉菌（Str.Verticillus）中提取的一种糖肽抗生素抗肿瘤药,是目前临床常用的广谱抗肿瘤药之一。在临床实践中,它与化疗药物结合使用后,用于治疗恶性淋巴瘤、生殖细胞肿瘤、鳞状细胞癌、黑色素瘤和恶性胸膜积液等具有较好的效果。因其本身无免疫抑制及骨髓抑制作用,在治疗急性骨髓白血病及帕金森综合症等方面亦有重大前景。但其存在肺炎样症状及肺纤维化症状的副反应,从而极大地限制了其临床应用。据报道,在接受BLM治疗的病人中,20%可产生肺毒性,其表现形式有多种,其中最严重的就是产生肺纤维化。因此,如何提高BLM的临床应用价值,寻找既能增强BLM抗肿瘤作用又能降低其肺纤维化副作用的辅助药物已成为现在研究的热点。中药野菊花为菊科植物野菊（Chrysanthemum indicum Linné.,C.indicum）的干燥头状花序,属药食两用花卉,广泛应用于茶剂、饮料、食品添加剂。可用于治疗各种传染性疾病,如头痛、眼疾以及各种与免疫相关的疾病,具有高效低毒的特点。药理研究表明,野菊花提取物具有显著的抗菌、抗炎、抗癌及其他药理作用。野菊花超临界萃取物(CI_SCFE)已广泛应用于许多经典处方和日常生活中,包括功能食品、化妆品及饮料中。研究报道CI_SCFE对于化疗药物,如顺铂引起的肾毒性具有保护作用。本课题组前期研究结果证实CI_SCFE对LPS诱导的急性肺损伤小鼠具有明显的保护作用,可显著改善小鼠的肺损伤程度;同时对于UV所诱导的光老化小鼠模型具有明显的保护作用。这些研究基础表明CI_SCFE具有良好的抗炎、抗氧化及肺保护功效,目前尚无CI_SCFE与BLM联合应用治疗肿瘤的相关文献,预示其与BLM可能具有潜在的协同作用,在增强BLM抗肿瘤作用的同时减轻其肺纤维化副作用。因此,本课题采用经典的H22腹水瘤小鼠模型探讨CI_SCFE对BLM的增效减毒作用并探讨其潜在的作用机制,为提高BLM临床疗效提供一定的理论依据。方法:1.野菊花超临界萃取物(CI_SCFE)化学成分分析野菊花超临界萃取物(CI_SCFE)用正己烷和75%甲醇超声萃取3次,浓缩正己烷部分后用GC-MS分析,75%甲醇部分用HPLC-PAD分析。2.CI_SCFE对BLM增效减毒的药效学研究本实验以KM小鼠为实验动物建立H22腹水瘤小鼠模型,H22肝癌细胞1×10⁷cells/mL腹腔注射至小鼠腹腔,每只0.2 mL。在该模型的基础上,腹腔注射BLM（7.5mg/kg）,同时灌胃给予CI_SCFE药物溶媒（240,360,480 mg/kg）对腹水瘤小鼠进行治疗,通过测量腹水瘤小鼠的外部特征（毛发,腹围,体重,行为活动及生存曲线）,观察CI_SCFE对BLM有无增效作用。在生存分析实验基础上,采用CI_SCFE中剂量继续进行后续实验。造模成功后,腹腔注射BLM（7.5 mg/kg）,同时灌胃给予CI_SCFE药物溶媒（360mg/kg）对腹水瘤小鼠进行治疗,连续给药7天,每天测量腹水瘤小鼠的体重和腹围,最后一天测量腹水体积。应用流式细胞仪检测H22腹水细胞凋亡,观察CI_SCFE能否增强BLM抗肿瘤作用。同时,剥取肺组织立即进行HE和Masson染色观察小鼠肺组织病理结构改变,研究CI_SCFE能否减轻BLM导致的肺纤维化。3.CI_SCFE对BLM增效减毒作用的机理研究在上述药效研究的基础上,选用CI_SCFE中剂量继续进行后续机理研究。应用Caspase活性检测试剂盒检测腹水细胞中Caspase 3及Caspase 8的活性,同时应用Western blot检测腹水细胞中p53蛋白的表达水平,进一步研究CI_SCFE增强BLM抗肿瘤作用的机制。此外,应用生化定量法检测肺组织中氧化因子（MPO和MDA）的活力;ELISA试剂盒测量炎症因子（TNF-α和IL-6）的水平;并应用Western blot检测TGF-β1蛋白的表达情况,考察CI_SCFE改善BLM肺纤维化的作用机制。最后应用QRT-PCR检测腹水细胞及肺组织中miR-29b基因的表达情况。成果:1.CI_SCFE化学成分分析GC-MS分析结果显示正己烷部分主要包含30种化合物,主要为萜类及烯类成分,其中含量较多的是E,E,Z-1,3,12-Nonadecatriene-5,14-diol（13.491%）,Octacosane（8.885%）,P21entacosane（8.62%）,Tetratriacontan（6.341%）,Tricosane（5.271%）,Heptacosane（2.885%）,Pentacosane（1.950%）,Octadecane,3-ethyl-5-（2-ethylbutyl）（1.769%）。HPLC分析结果表明75%甲醇部分主要含5种成分,分别为木犀草素、芹菜素、槲皮素、蒙花苷、金合欢素。2.CI_SCFE对BLM增效减毒的药效学研究在H22腹水瘤小鼠模型中,与正常组相比,模型组小鼠体重、腹围急剧增加,生存时间显著缩短。与模型组相比,CI_SCFE单独给药（240、360、480 mg/kg）对H22腹水瘤小鼠生存时间无明显作用,无统计学差异;与模型组相比,BLM单独剂量组（7.5mg/kg）可显著延长H22腹水瘤小鼠的生存时间,具有统计学意义;CI_SCFE与BLM联合给药组（尤其是360,480 mg/kg）可以显著提高腹水瘤小鼠生存率,根据生存分析的结果,CI_SCFE中剂量继续用于后续实验研究。此外,与BLM单独组相比,BLM与CI_SCFE联合用药后,可显著提高腹水细胞的凋亡率,从而增强BLM的抗肿瘤作用。同时,与BLM单独组相比,联合用药后,可显著改善由BLM导致的肺纤维化及肺部炎症浸润情况,初步表明CI_SCFE可减轻BLM导致的肺纤维化。3.CI_SCFE对BLM增效减毒作用的机理研究Caspase活性检测试剂盒结果表明,与BLM单独组相比,BLM+CI_SCFE联合给药组可显著增加腹水细胞中Caspase 3和Caspase 8活性,且上调p53蛋白表达,从而增强BLM抗肿瘤作用;另一方面,与BLM单独组相比,联合用药后可显著降低肺组织中氧化因子（MPO和MDA）和炎症因子（TNF-α和IL-6）的水平,同时下调肺组织中TGF-β1蛋白表达,从而减轻BLM导致的肺纤维化。QRT-PCR结果表明,与单独给药组相比,联合用药后可显著增加腹水细胞及肺组织中miR-29b的表达水平。结论:本试验应用H22腹水瘤小鼠模型,首次发现CI_SCFE对BLM具有较好的增效减毒作用。其机制可能与调节p53和TGF-β1信号通路的平衡有关。通过促进腹水细胞的凋亡以及上调腹水细胞中p53蛋白的表达从而增强BLM抗肿瘤作用;同时降低肺部炎症、氧化反应及肺纤维化的程度,并下调TGF-β1蛋白表达,从而改善BLM导致的肺纤维化。