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内皮细胞屏障具有重要的功能。肺内皮细胞屏障是一个半渗透膜,位于血管与周围组织之间,调节体液平衡,维持内环境的稳定[1]。内皮细胞屏障破坏常发生于各种疾病的早期,如急性肺损伤(ALI)等[2],如果纠正不及时甚至可威胁生命。内皮细胞维持其屏障功能完整主要依赖于两方面:内皮细胞骨架结构的完整及紧密的细胞间连接[3,4]。目前已知多种原因可造成内皮细胞屏障功能破坏,如感染诱发炎症因子(TNFα)增加等,有害因素可造成不同程度的细胞收缩,细胞连接缝隙出现,细胞骨架结构重排,进而导致细胞屏障完整性破坏,造成血管内外液体平衡失调。此外,前炎症因子如TNFα可诱导内皮细胞caspase活动增加,激活凋亡信号途径,细胞调亡增加,有报道称caspase活动增加可影响部分细胞连接蛋白,均可导致内皮细胞屏障通透性增强。本文主要针对TNFα、LPS等损伤因素造成的内皮细胞屏障功能障碍进行研究,阐述其主要机制及HDAC6抑制后对上述损害的保护作用分子机制。HDAC6是IIb类去乙酰化酶,主要通过去乙酰化及泛素化作用调节底物发挥功能[5]。已知HDAC6底物主要包括α-tubulin,HSP90,cortactin[6-9]。近年来许多研究表明抑制HDAC6基因表达具有明确的抗肿瘤,免疫抑制,抗炎作用[10-15],但其分子机制仍不明确。体外实验中TNFα刺激肺内皮细胞诱导细胞屏障通透性增加主要通过以下途径[16-18]:1、细胞连接破坏:VE-cadherin与β-catenin复合物形成是维持细胞连接完整性的重要组成,TNFα刺激后可造成上述复合物的不稳定从而导致细胞间缝隙出现;TNFα可诱导肺内皮细胞caspase 3活动增加,也可引起细胞间连接破坏。2、细胞骨架结构重排:细胞微管结构是构成细胞骨架的主要组成部分,主要有α-tubulin及β-tubulin两种单体,二者以聚合体形式存在,维持微管结构完整性,TNFα可导致这种聚合形式破坏,一方面影响细胞微管结构完整性,同时可导致细胞骨架另一结构即细胞微丝结构(Factin,P-MLC)重排。特异性HDAC6抑制剂或HDAC6基因敲除可通过对其底物α-tubulin及β-catenin的乙酰化作用及降低caspase 3活动有效抑制上述改变的发生,从而维持细胞屏障功能的完整性。实验第一部分为体外细胞实验,掌握特异性HDAC6抑制剂或HDAC6基因敲除对细胞屏障功能保护作用及其分子机制。通过TNFα刺激肺动脉血管内皮细胞及肺微血管内皮细胞建立炎症反应模型,我们可观察到实验组细胞屏障通透性明显增加,细胞形态改变,细胞连接破坏(VE-cadherin及β-catenin复合体破坏),微管结构聚合形式降低而α-tubulin单体形式增加,F-actin增加及P-MLC表达增加,同时也观察到cleaved caspase3(c-caspase3)蛋白含量明显升高,提示caspase3活动性增加。而预先应用特异性HDAC6抑制剂干预或者应用si RNA基因敲除HDAC6蛋白后给予TNFα刺激可明显减轻上述改变,同时可检测到α-tubulin及β-catenin乙酰化表达增加,c-caspase3蛋白含量降低,结合以往文献报道,我们认为特异性HDAC6抑制剂或HDAC6基因敲除具有减轻TNFα诱导的内皮细胞通透性增加的作用,主要通过诱导α-tubulin及β-catenin乙酰化表达增加及降低caspase3活动,从而维持细胞连接完整性及细胞微管结构稳定性。实验第二部分为体内动物实验,本部分实验应用两种动物模型即LPS腹腔注射诱导脓毒血症模型及盲肠结扎穿刺术诱导脓毒血症模型。LPS模型组:特异性HDAC6抑制剂(Tub A 9mg/ml及CAY10603 3mg/ml)或DMSO腹腔注射6h后,给予LPS 7.5mg/kg腹腔注,LPS注射24h后收集标本;CLP模型组:CLP手术后或模拟手术后1小时给予特异性HDAC6抑制剂(Tub A 9mg/ml及CAY10603 3mg/ml)腹腔注射,术后24小时处死小鼠,收集样本。实验项目包括测量肺干湿重比,MPO活性,Ace-α-tubulin,Ace-β-catenin,c-caspase3蛋白。我们观察到Tub A或CAY10603干预组较单独应用TNFα组小鼠肺干湿重比及MPO活性明显降低,说明小鼠肺水肿明显改善,炎症减轻,同时检测到TNFα组Ace-α-tubulin及Ace-β-catenin蛋白量较对照组明显降低而Tub A或CAY10603干预组则基本恢复到对照组相同表达水平。进一步说明特异性HDAC6抑制剂可改善炎症介导的肺内皮细胞屏障通透性增加,主要通过诱导底物α-tubulin及β-catenin乙酰化表达增加及抑制caspase3活动性。综上所述,特异性HDAC6抑制剂或HDAC6基因敲除可减轻炎症介导的肺内皮细胞屏障功能障碍,主要通过诱导α-tubulin及β-catenin乙酰化作用及降低capase3活动性,从而增加细胞连接及细胞骨架结构的稳定性,维持细胞屏障功能的完整性。