心理应激在肿瘤的发生、发展中扮演重要角色。丰富生存环境（Enriched environment,EE）是一种良性心理应激,既往研究显示,EE能普遍抑制小鼠不同肿瘤的生长,但其机制目前尚不清楚,特别是免疫相关机制尚缺乏深入探讨。本课题将在我们前期研究成果的基础上,从NK细胞和T淋巴细胞分析入手,并聚焦于神经-免疫调控,深入探讨EE产生这一肿瘤抑制作用的免疫学机理。本课题从以下三部分进行研究:第一部分EE抑瘤作用中关键免疫效应细胞的鉴定目的:明确介导EE抑制肿瘤生长作用的关键免疫效应细胞。方法:1.3周龄雄性野生型C57BL/6小鼠、Beige小鼠（NK细胞杀伤功能缺陷）、Rag1-/-小鼠（T、B细胞缺陷）于EE（和常规环境相比具有更多的空间、更多的玩具以及更多的伙伴）或常规环境（Standard Environment,SE）中饲养3周后,分别建立Panc02胰腺癌和Lewis肺癌皮下移植瘤模型,观察肿瘤重量和肿瘤体积的变化。2.腹腔注射anti-asialo GM1抗体进行体内NK细胞敲除实验,观察肿瘤重量和肿瘤体积的变化。结果:1.在野生型C57BL/6小鼠中,EE饲养能显著抑制Panc02胰腺癌和Lewis肺癌皮下移植瘤的生长（P均<0.05）,抑瘤率分别为44.3%和39.4%;在T、B淋巴细胞缺陷的Rag1-/-小鼠中,EE同样能显著抑制肿瘤的生长（P均<0.05）,抑瘤率为40.4%和36.9%;而在NK细胞缺陷的Beige小鼠中,EE对肿瘤的生长没有明显的影响（P均>0.05）。2.在T、B细胞缺陷的Rag1-/-小鼠中,通过腹腔注射anti-asialo GM1抗体敲除NK细胞,结果显示在NK细胞敲除的小鼠中,EE对Panc02胰腺癌皮下移植瘤的生长没有明显的影响。结论:NK细胞而非T、B细胞介导的抗肿瘤免疫在EE抑瘤中具有很重要的作用。第二部分NK细胞介导EE抑瘤作用的机制研究目的:探讨NK细胞介导EE抑瘤作用的分子机制。方法:3周龄雄性野生型C57BL/6小鼠和3周龄雄性Rag1-/-小鼠均随机置于EE或SE中饲养3周后,建立Panc02胰腺癌皮下移植瘤模型,分别进行1-3实验和4-5实验:1.流式细胞检测和免疫组化观察EE饲养对小鼠脾脏、血液和肿瘤组织中NK细胞数量的影响。同时,用免疫磁珠法富集脾脏NK细胞,观察EE对NK细胞杀伤活性的影响。2.用免疫磁珠法富集脾脏NK细胞,Real-time PCR和流式细胞术分别检测EE对富集的NK细胞和脾NK细胞的趋化和杀伤相关受体以及杀伤效应分子表达的影响。同时,Real-time PCR及Western blot检测肿瘤组织中相应配体的表达水平。3.用免疫磁珠法富集NK细胞,特异性抗体或阻断剂体外阻断NK细胞活化受体NKG2D或趋化因子受体CCR5的功能,观察对EE增强NK细胞杀伤活性及趋化作用的影响。4.在Rag1-/-小鼠中建立EE抑制胰腺癌皮下移植瘤模型的同时,注射特异性抗体或抑制剂体内阻断NKG2D或CCR5的功能,观察对EE抑瘤作用的影响,用流式检测CCR5阻断后肿瘤浸润的NK细胞变化。5.利用RNAi技术下调Panc02细胞中主要的NKG2D配体Mult1的表达,并用该细胞在Rag1-/-小鼠建立皮下移植瘤模型,观察EE饲养对缺乏NKG2D配体表达的肿瘤的抑制作用。结果:1.EE饲养能增加荷瘤小鼠外周NK细胞的比例（P<0.05）,并能显著促进NK细胞在肿瘤组织中的浸润（P<0.05）。同时,EE可以明显增强NK细胞对YAC-1细胞和Panc02肿瘤细胞的杀伤活性。2.EE明显增加外周及肿瘤组织中侵润的NK细胞活化受体NKG2D和趋化因子受体CCR5的表达（P均<0.05）。然而,EE对肿瘤细胞NKG2D和CCR5配体的表达水平没有显著的影响。3.NKG2D特异性阻断抗体处理NK细胞,能消除EE增强NK细胞对Yac-1细胞和Panc02肿瘤细胞杀伤活性的作用。同时,用CCR5抑制剂DAPTA处理NK细胞,则能消除EE增强NK细胞趋化迁移的作用。4.给予小鼠注射NKG2D特异性阻断抗体或CCR5抑制剂后,能消除EE抑制肿瘤生长的作用。同时,注射CCR5抑制剂还能消除EE促进NK细胞肿瘤侵润的作用。5.EE并不能显著影响NKG2D配体Mult-1缺乏的Panc02皮下移植瘤的生长。结论:EE通过增加NK细胞表面NKG2D、CCR5的表达,促进NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性以及在肿瘤组织中的侵润,从而达到抑瘤作用。第三部分交感神经在调节NK细胞参与EE抑瘤作用的研究目的:探讨交感神经在EE增强NK细胞抗肿瘤免疫中的作用。方法:1.在EE和SE饲养的C57BL/6小鼠建立Panc02胰腺癌皮下移植瘤模型,通过口服给予β肾上腺素受体阻断剂普奈洛尔（阻断了交感神经释放的递质与免疫细胞的作用）观察对EE抑瘤和增强NK细胞抗肿瘤作用的影响。2.在EE和SE饲养的C57BL/6小鼠建立Panc02胰腺癌皮下移植瘤模型,通过手术切断小鼠脾神经（脾神经98%为交感神经）,观察对EE抑瘤和增强NK细胞抗肿瘤作用的影响。3.建立血清转移模型:3周龄雄性C57BL/6小鼠进入EE和SE 3周后,皮下接种Panc02细胞,一周后取血清,腹腔注射另一批常规饲养C57BL/6小鼠,隔一天注射一次,共4次,取脾脏富集NK细胞,观察NK细胞杀伤活性。结果:1.阻断β肾上腺素受体后,不仅能消除EE增强NK细胞的杀伤活性的作用,同时也消除EE对肿瘤生长的抑瘤作用,提示交感神经可能参与EE对NK细胞杀伤的调节从而抑瘤。2.手术切断脾神经（98%交感神经）能消除EE增强NK细胞的杀伤活性的作用,同时也消除EE的抑瘤作用,进一步说明交感神经可能参与EE增强NK细胞的杀伤活性的调节从而抑瘤。3.EE荷瘤小鼠血清注射后,对NK细胞杀伤活性没有明显影响（P>0.05）,提示血清中的成分可能不是EE调节NK细胞杀伤功能的主要因素。结论:本部分结果提示EE可能通过交感神经调节NK细胞抗肿瘤免疫达到抑瘤。