荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)定量检测技术可以真实反映分子间相互作用的程度,其中基于发射光谱分离的FRET定量检测技术具有灵敏、实时、无损伤等优点,被认为是最适合用于动态监测活细胞内蛋白质相互作用以及构象变化的技术之一。本文根据发射光谱分离FRET(Ⅰem-spFRET)和改进的发射光谱分离FRET(Ⅱem-spFRET)定量检测理论,设计并构建了宽场光谱分离FRET系统。该系统能够根据实验需求对激发滤光片和发射滤光片进行自由组合,扩大了 FRET荧光探针的选择范围。考虑双光子具有穿透能力好,光漂白小的优点,我们搭建了双光子发射光谱分离FRET系统,可实现激发波长680 nm-1080 nm调节,适合进行长时间的动态监测。最后利用转染了质粒Cerulean,Venus,C32V,CTV,CVC,VCV,VCVV的HeLa细胞作为研究对象,对所搭建的宽场和双光子系统进行FRET定量检测与分析。结果表明,宽场发射光谱分离FRET系统和双光子发射光谱分离FRET系统能够准确测量FRET效率和受供体浓度比,实现FRET定量检测。研究成果为在活细胞中开展生物分子相互作用的实时光学检测提供了一种有效的方法和手段。