研究背景:骨性关节炎(Osteoarthritis,OA)是最常见的年龄相关性关节退行性疾病之一,以慢性关节炎症、关节软骨组织破坏、软骨下骨质硬化及骨赘逐渐生成为主要特征。OA早期症状以受累关节疼痛、僵硬,活动能力下降为主,晚期将导致关节功能丧失而致残,这不仅极大地影响着患者的身体健康及生活质量,还持续增加着家庭及社会的人力与财力负担。由此,OA的预防与治疗已经逐渐成为一项急需解决的医学难题。此外,当前OA的临床治疗方法有限,主要为对症治疗,缺乏有效的对因治疗手段,关节置换常常是终末期OA的唯一选择。因此,深入研究OA的病理过程,探索其确切的致病机理及调控机制,对于OA的防治具有重要的临床价值和社会意义。环状RNA(circular RNA,circ RNA)是一种新近发现的内源性RNA分子。与传统的线性RNA结构不同,circ RNA既没有5’端帽子,也没有3’端尾巴,其闭合的环状结构由序列通过共价键形成。Circ RNA主要由pre-m RNA通过可变剪接加工产生,具有表达丰富、组织特异性高及稳定性好等特点。研究表明,circ RNA具有强大的生物学功能,可在转录及转录后水平对基因表达进行调控。Circ RNA可以参与调控机体正常细胞生长发育、维持干细胞特性,也可以在心衰、椎间盘退变、肿瘤等多种疾病的发生发展过程中,发挥关键的调节作用。然而,虽然circ RNA在机体生理功能及多种疾病中的作用已被大量研究阐述,circ RNA参与OA疾病进程的相关报道国内外数量甚少,有待进一步研究。研究目的与方法:本研究运用芯片技术,检测了circ RNA在OA软骨组织和正常软骨组织中的表达情况。通过PCR、Sanger测序、Northern blot等方法,对Circ CDH13的差异表达情况及其环化特性进行了验证。采用体外干扰、过表达技术,在软骨细胞中进行了Circ CDH13的功能获得及缺失实验,以Annexin V-FITC流式细胞仪及TUNEL染色对软骨细胞凋亡进行检测,以Western blot、细胞免疫荧光对软骨细胞中MMP13、Col2a1、ADAMTS-5及Aggrecan的表达进行检测。通过生物信息学预测、RNA pulldown等方法,结合双荧光素酶报告基因实验预测并验证Circ CDH13与mi R-296-3p及mi R-296-3p与PTEN的靶向结合。利用腺相关病毒沉默小鼠体内Circ CDH13表达,通过番红-固绿染色、X线及micro-CT检测Circ CDH13沉默对DMM诱导的小鼠膝关节OA的作用,并以Western blot、免疫组化检测MMP13、Col2a1、ADAMTS-5及Aggrecan的表达情况。研究结果:我们的研究发现,相比正常软骨组织,人OA软骨组织中存在大量circ RNA差异表达,其中,Circ CDH13在OA软骨组织及IL-1β诱导的OA体外细胞模型中表达量均显著增高。Sanger测序结果显示Circ CDH13的反向剪接位点附近序列与Circ Base数据库一致,Northern blot结果证实Circ CDH13在c DNA中可被双向引物扩增,同时PCR结果表明Circ CDH13可以抵抗RNase R酶的消化。通过RNA干扰及过表达技术,以IL-1β建立OA体外模型,在体外研究Circ CDH13对OA中软骨细胞的作用。结果显示,Circ CDH13体外干扰时,相比IL-1β刺激组,si RNA转染组软骨细胞凋亡率显著降低,软骨细胞细胞外基质Col2a1、Aggrecan表达量显著增加,基质降解酶MMP13、ADAMTS-5表达量显著减少;而Circ CDH13体外过表达时,软骨细胞凋亡率显著增加,Col2a1、Aggrecan合成减少,MMP13、ADAMTS-5分泌增多。细胞“核质”分离实验显示,Circ CDH13主要定位于软骨细胞细胞质中。mi Randa与Target Scan数据库预测及Circ CDH13 pulldown检测发现mi R-296-3p是Circ CDH13的靶向mi RNA。双荧光素酶报告基因实验结果显示,相比对照组,与mi R-296-3共转染后,Circ CDH13-wt组荧光检测强度显著下降,而Circ CDH13-mut组荧光检测强度变化无统计学差异,表明mi R-296-3p可直接与Circ CDH13靶向结合。PCR检测发现,mi R-296-3p在OA软骨组织中显著低表达。功能实验结果进一步表明,mi R-296-3p体外过表达可显著抑制IL-1β及Circ CDH13诱导的软骨细胞凋亡,Col2a1、Aggrecan降解及MMP13、ADAMTS-5合成。Target Scan数据库预测PTEN为mi R-296-3p下游靶基因,双荧光素酶报告基因实验发现,与mi R-296-3p共转染后,相比对照组,PTEN 3’UTR wt组荧光检测强度显著降低,而PTEN 3’UTR mut组荧光检测强度变化无统计学差异,表明mi R-296-3p可直接与PTEN靶向结合。Western blot结果显示,PTEN在OA中显著高表达。PTEN功能实验显示,PTEN过表达显著上调软骨细胞凋亡率,同时显著降低Col2a1、Aggrecan表达,升高MMP13、ADAMTS-5表达。功能实验结果进一步表明,在软骨细胞中,mi R-296-3p可以通过对PTEN表达的负向调控,显著抑制PTEN诱导的软骨细胞凋亡、Col2a1、Aggrecan的降解及MMP13、ADAMTS-5的合成。研究还发现,Circ CDH13在小鼠中存在同源的circ RNA(mmu＿circ＿0014630),人鼠来源的Circ CDH13(hsa＿circ＿0040646与mmu＿circ＿0014630)序列同源性达89%。构建Circ CDH13腺相关病毒沉默载体,小鼠关节腔内注射治疗8周后,结果显示,相比DMM组,小鼠体内Circ CDH13沉默组小鼠膝关节软骨破坏减轻,骨赘生成减少,同时软骨细胞细胞外基质Col2a1、Aggrecan合成增加,基质降解酶MMP13、ADAMTS-5分泌减少。结论:综上所述,本研究通过体内外实验,发现OA软骨组织中存在大量circ RNA差异表达,其中Circ CDH13在OA软骨组织及OA体外细胞模型中表达量均显著增高。功能上,高表达的Circ CDH13主要通过诱导软骨细胞凋亡,促进软骨细胞细胞外基质降解及其降解酶的合成,进而促进OA的发生发展。机制上,定位于软骨细胞细胞质中的Circ CDH13可以作为mi R-296-3p海绵,通过与mi R-296-3p靶向结合,解除mi R-296-3p对其下游靶基因PTEN表达的抑制,参与OA进程的调控。Circ CDH13在人与小鼠中高度同源,体内沉默小鼠Circ CDH13后,可减少DMM诱导的小鼠膝关节软骨破坏,骨赘生成,以及软骨细胞细胞外基质降解及其降解酶的分泌,有效地缓解了DMM诱导的小鼠膝关节骨性关节炎的进展。