研究背景先天性巨结肠病(Hirschsprung,s disease,HSCR)被称之为肠道无神经节细胞症,它是由于胚胎期肠神经嵴细胞发育障碍造成的肠畸形,同时也是一种多基因缺陷遗传病,在小儿先天性肠管动力障碍疾病中属于最常见的类型。先天性巨结肠病具有一定的遗传倾向,据统计,其发病率大约占到新生儿活胎的1/4000-5000,在比例上,男:女约为4:1。现有研究将HSCR的发病归因于患儿胚胎发育进程的异常。在胚胎神经发育的初期,某些物质干预肠神经嵴细胞(the enteric neural crest cells,ENCCs)在分化、迁移、定植的过程,从而使肠神经系统发育迟缓甚至停滞,进而病变肠道的粘膜下和肌内层神经节细胞呈现不同长度或程度的缺失,相关受累及的肠段出现异常收缩导致狭窄,受累肠管近端结肠出现梗阻性扩张,并逐渐肥厚,最终形成此病。先天性巨结肠临床表现为难治性排便困难和腹胀等下消化道梗阻症状,是一种严重影响小儿健康的先天性肠道系统疾病。由于导致先天性巨结肠的原因以及其发病机制仍未明确,保守治疗效果欠佳,所以手术治疗仍然是目前根治小儿先天性巨结肠的最佳方法。该病常发生于婴幼儿时期,手术创伤较大,风险较高,术后容易出现并发症,这不仅给术后管理带来困难,而且使得患儿未来的生活质量受到严重影响。所以目前除了手术治疗之外,能否发现其他根治先天性巨结肠的治疗方法,是近年来许多学者研究的重点和难点。根据目前的研究和总结,我们发现小儿先天性巨结肠是有诸多因素综合作用所导致,其中诸因素中最为重要是遗传因素。近年来,HSCR的基因研究受到众多研究者青睐,并初具成效。大量的研究结果表明HSCR患儿存在多种基因和信号通路的表达异常。目前为止,研究者通过分子生物学实验及遗传学分析,发现了许多和HSCR发病相关的基因,例如:内皮素B受体(endothelin B receptor,EDNRB)、原癌基因RET、内皮素3(endothelin3,EDN3)、内皮素转换酶1(endothelin converting enzyme 1,ECE1)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、神经营养蛋白(neurturin,NTN)、SEMA3C、SEMA3D、NRTN、SOX10、TCF4、Phox2B、KIAA1279、SIP1(smad2 interacting proteinl)、NRG1、GFRα 1、PSPN、ZFHX1B及L1CAM等。这些基因大多可直接或间接的作用于机体内相关的信号通路,从而进一步干扰肠管神经崤干细胞的分化、迁移及增殖。这些过程出现障碍即是肠管神经嵴干细胞定植于肠道,形成先天性巨结肠的根本原因。miRNAs(microRNA,微小RNA)作为一类内源性RNA,分子很小,仅由19-23个核苷酸构成的。这种非编码单链小分子RNA是以碱基对配对的方式与其自身靶基因mRNA分子的3’ UTR区即3’非编码区结合,这种特异性的结合引发了靶基因mRNA的翻译抑制(不完全结合)或降解(完全结合),从基因层面上影响调控转录后翻译水平的基因表达。目前的大量研究已发现,miRNAs基因量多,表达丰富,在多种生命过程中,其中包括各种细胞的增殖与调亡、个体器官的发育、系统功能的维持、多种应激反应及许多疾病的发病等,都发挥着非常重要的作用。已经证实了神经系统的发育与miRNA密切相关,因此,肠神经系统的发育也很可能和miRNA的基因调控作用有关联。通过目前的一些研究,已经发现miRNAs参与调控了肠神经嵴干细胞的分化、迁移、增殖和调亡的一系列基因表达过程,其和HSCR(先天性巨结肠)的发病相关。研究者对此进行了研究分析发现,HSCR患者的狭窄段肠管组织中的确存在着多种miRNAs的异常表达,如:MiR-200a、MiR-141、miR-939、miR-195、miR-218-1、miR-150-5p、miR-124及miR-206 等。在HSCR患者的狭窄段肠管组织中,这些miRNAs有些表达升高,有些表达降低,一般均通过与相应的靶基因结合,在基因水平上参与了先天性巨结肠的发病过程。但由于目前miRNAs在小儿巨结肠中的研究仍不足,很多研究还处于初级阶段。这种先天性疾病的发病机制仍需要大量的研究去阐明。为了进一步探索miRNAs在该病发病机制中的作用,我们需要集中先天性巨结肠组织中的miRNAs,建立表达谱,筛选出其中一些特异性的miRNA,应用现有的基因技术,进行深入研究。在技术层面上,众多研究者目前广泛采用的是miRNA基因芯片技术。由于这种技术具有的高特异性和高灵敏度的优点,因此被认为是一种理想的高通量检测方法,在实际使用中效果非常好。本课题中,我们也采取了这种检测技术。我们利用该技术对切除的病变肠管扩张段与狭窄段肠管组织中差异表达的miRNAs进行甄别、归类、初筛,并建立miRNAs表达谱,从而初步对小儿HSCR病变肠管组织的miRNAs表达谱有大体基本的了解。按照惯例我们把Fold Change≥2且p<0.05定为对miRNA表达有显著性差异的判断标准。通过对miRNAs基因芯片筛选,在一些小儿先天性巨结肠病变肠管组织(扩张段和狭窄段)中很可能存在异常表达的miRNAs,这些结果很可能存在假阳性,所以需要我们进一步去筛选这些miRNAs,接下来我们通过qRT-PCR验证,并将其与miRNA基因芯片筛选进行比对,获得相同的miRNA。选定我们要研究的miRNA后,首先,我们将进行一系列的体外细胞学实验去探索我们选定的miRNA在先天性巨结肠发病中的作用;然后,我们将通过生物信息学进行靶基因预测并进行相关的实验进行验证;最后,我们会对此miRNA导致HSCR发病的相关信号通路进行相应的研究。材料和方法材料:收集在山东省立医院就诊并手术的32例散发性先天性巨结肠患儿的肠狭窄段及扩张段手术标本,其中男22例,女10例;年龄4月-5岁。经术前钡造影、直肠肛管测压、病理结果证实。4例进行芯片检测,28例进行扩大样本量验证。方法:1、利用miRNAs基因芯片(芯片由上海康成生物科技有限公司提供)进行筛选,发现差异表达的miRNA,miRNAs表达有显著性差异判断标准为FoldChange ≥2 且 p<0.05。2、通过对HSCR组织miRNA基因芯片扫描结果进行筛选及分析,最终选出目前尚未报道而且和神经发育关系比较密切的miR-140-5p作为研究对象,并进一步行qRT-PCR验证。3、选取SH-SY5Y细胞(人神经母细胞瘤细胞)和293T细胞(人肾上皮细胞)进行体外细胞学实验。慢病毒干扰下调SH-SY5Y和293T细胞中miR-140-5p的表达,将其分为阴性对照组、病毒空转组、miR-140-5p敲除组。qRT-PCR检测细胞转染的效率高低;CCK-8实验检测各组细胞转染后的增殖能力变化;Transwell细胞迁移实验及划痕实验检测敲除miR-140-5p后,各组细胞迁移能力变化的影响;Western blotting检测miR-140-5p敲除后调亡及自噬相关的蛋白(Bax、Beclin-2、cleaved-caspase-3、pro-caspase-3、cleaved-parp-1)的表达情况;流式细胞仪用于检测细胞凋亡情况并记录其变化;4、运用生物信息学软件进行预测miR-140-5p的靶基因为EGR2,并进一步验证在先天性巨结肠中miR-140-5p是通过调控EGR2发挥作用。5、Western blotting、免疫组化及免疫荧光检测先天性巨结肠病变肠管组织与正常肠管组织中EGR2的相对表达情况;Western blotting检测EGR2在各组细胞中的表达情况;6、Western blotting检测AKT信号通路相关蛋白(p-AKT、AKT)的表达情况,并进行相关实验分析AKT信号通路在HSCR发病中的作用。7、统计学方法:采用SPSS19.0(SPSS公司,芝加哥,USA)统计软件。本课题实验数据均采用t检验(Student’s t-test)、x 2检验或Fisher精确法进行统计学分析,P<0.05为差异具有统计学意义。结果一、小儿巨结肠狭窄段及扩张段miRNA基因芯片检测结果通过基因芯片检测结果表明:与扩张段组织相比,狭窄段组织中有40种差异表达miRNA(显著性差异判断标准为Fold Change≥2且p<0.05。),其中24 种 miRNA 高表达,比如:miRNA-483-5P、miRNA-218-1、miRNA-195、miRNA-124、miRNA-25、miRNA-133a等,具体结果见表1-1;16种miRNA低表达,比如:miRNA-141-3P、miRNA-373-5P、miRNA-9-5P、miRNA-140-5P 等,差异存在统计学意义(P<0.05),数据总结见表1-2。选取下调miRNA中差异表达明显、目前尚未报道而且和神经发育关系比较密切的miR-140-5p作为研究对象。qRT-PCR扩大样本验证miR-140-5p在小儿巨结肠狭窄段组织中呈低表达,和miRNA基因芯片结果一致。二、体外细胞学实验及相关功能学试验验证1.CCK8试验表明miR-140-5p的下调降低了细胞的增殖能力;Western blotting检测凋亡相关蛋白结果显示miR-140-5p的下调促进细胞凋亡;流式细胞结果表明miR-140-5p的下调促进了 SH-SY5Y和293T的凋亡;划痕实验表明miR-140-5p的下调导致细胞迁移能力的下降;而Transwell实验结果进一步表明miR-140-5p的下调降低了细胞的迁移能力。2.运用靶基因预测软件Targetscans预测miR-140-5p作用于巨结肠的靶基因可能为EGR2。双荧光素酶实验证明miR-140-5p可以对EGR2的3’ UTR起到抑制性调控作用。共转染实验证明,在HSCR中,miR-140-5p通过调控靶基因EGR2发挥作用。3.Western blotting、免疫组化及免疫荧光实验结果显示EGR2在狭窄段肠管组织中的表达水平显著上调;miR-140-5p表达与EGR2呈现明显的负相关,SH-SY5Y和293T在敲低miR-140-5p后EGR2的表达明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.Western blotting 结果显示 SH-SY5Y 和 293T 在敲除 miR-140-5p 后,信号通路相关蛋白P-AKT下调,使用Akt通路激活剂SC79后,细胞的生物学行为得到恢复。提示下调miR-140-5p可能通过其靶基因EGR2抑制AKT信号通路,进而抑制SH-SY5Y和293T的增殖、迁移能力,同时促进其凋亡。说明miR-140-5p能够利用Akt信号通路参与HSCR发病。结论1、先天性巨结肠狭窄段肠管和扩张段肠管存在miRNA表达差异,多种miRNAs参与了小儿先天性巨结肠的发生、发展,有待于进一步研究。2、MiR-140-5p在小儿先天性巨结肠狭窄段组织中下调,抑制肠神经嵴干细胞在肠道的增殖、迁移及分化,诱导凋亡,促使HSCR在胚胎早期的发生发展。3、MiR-140-5p可能通过调控其靶基因EGR2抑制AKT信号通路参与HSCR的发病机制。