组织损伤或神经系统疾病严重影响着人类的生命健康和生活质量，移植外源性干细胞修复受损部位或重塑神经组织是目前治疗这些疾病的主要策略，但神经干细胞（neural stem cells, NSCs）或胚胎干细胞（embryonic stem cell, ESCs）由于来源和伦理等问题不能被广泛应用于干细胞移植。间充质干细胞（mesenchymalstem cells, MSCs）是一类多潜能成体干细胞，因其具有来源广泛、体外增殖快和免疫原性弱等优势，迅速成为理想的组织工程种子细胞。体内外实验证实MSCs可以沿着趋化因子（HGF、VEGF、SDF）浓度梯度的方向向损伤部位迁移，修复受损的组织，但是关于细胞迁移的具体调控机制目前尚不清楚。Wnt/β-catenin信号通路不仅影响肿瘤的发生发展和转移，对干细胞的增殖、分化和迁移同样具有重要的调控作用。研究发现许多细胞因子如HGF、VEGF等可以激活Wnt/β-catenin信号通路，影响细胞的分化和迁移，此过程中没有Wnt蛋白的参与。本文旨在研究肝细胞生长因子（HGF）诱导MSCs趋化性迁移过程中，Wnt/β-catenin信号通路的激活情况以及转录因子TCF4在迁移过程中的作用，在此基础上进一步揭示与迁移相关的Wnt靶基因的转录变化。此外本文还探讨了Wnt/β-catenin信号通路对MSCs细胞骨架重排的影响。本研究首先采用Percoll法从SD大鼠的骨髓中成功分离和纯化MSCs，并以此细胞为实验材料，检测HGF对MSCs中Wnt/β-catenin信号通路的影响。Western blot结果显示HGF能够增加MSCs中β-catenin蛋白的表达，具有剂量依赖性，50ng/mlHGF使β-catenin的蛋白表达水平增加了2倍。接着我们用50ng/ml HGF处理MSCs不同的时间，发现HGF处理30min，MSCs中β-catenin表达开始增加，具有显著性差异，一直到240min MSCs中β-catenin仍处于较高的表达水平。免疫荧光染色结果显示，50ng/ml HGF处理MSCs30min，细胞质中β-catenin开始累积，并具有向细胞核转移的趋势；处理60min，β-catenin完全入核；在处理的240min内，β-catenin没有明显出核或降解迹象。此外，通过TOPFlash/FOPFlash双荧光素酶报告基因检测HGF处理MSCs后细胞中TCF/LEF转录活性的变化，与对照组相比，50ng/ml HGF处理MSCs60min，细胞中的TOPFlash报告基因活性增加了4倍，但FOPFlash报告基因没有明显的变化。以上这些结果说明50ng/ml HGF能够激活MSCs中Wnt/β-catenin信号通路。本实验室前期工作发现，HGF能够诱导MSCs发生趋化性迁移，呈现剂量依赖性，50ng/ml HGF使细胞的迁移总数达到最大值；为了检测激活的Wnt/β-catenin信号通路是否参与MSCs向HGF的趋化性迁移过程，我们引入Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂FH535和激活剂LiCl，采用Boyden chamber装置进行细胞群体性迁移的实验研究。检测结果发现抑制剂FH535明显抑制了MSCs向HGF的迁移，其中5μM FH535使细胞的迁移总数下降了30%，20μM FH535使迁移总数的下降超过了50%；用LiCl激活Wnt/β-catenin信号通路则可以进一步促进MSCs向HGF的趋化性迁移。此外，我们利用Dunn chamber装置检测了FH535和LiCl对单细胞迁移轨迹的影响，结果显示，相比于对照组，FH535降低了MSCs向HGF迁移的速度和迁移效率；而LiCl增加了细胞的迁移速度，对迁移效率没有明显影响。转录因子TCF/LEF家族在Wnt/β-catenin信号通路中起着分子开关的作用，因此接下来首先检测MSCs中TCF/LEF的表达亚型，结果显示虽然MSCs中TCF/LEF四种亚型的转录因子都有表达，但是TCF4的相对表达水平远远高于其它三种亚型，并且50ng/ml HGF处理MSCs60min后，TCF4mRNA和蛋白表达水平都明显上升，一直持续到240min。免疫荧光染色结果显示50ng/ml HGF处理MSCs60min能显著增加TCF4在细胞核内的积累。对β-catenin和TCF4的共定位染色发现HGF在促进β-catenin聚集到细胞核的同时，核内的TCF4也明显增加，两者呈现共定位关系。为进一步揭示TCF4在MSCs中的功能，我们构建了TCF4全长以及缺失了与β-catenin结合序列的功能突变型重组腺病毒载体，在QBI-293A中进行包装和扩增，并筛选出重组腺病毒感染MSCs的最适病毒复数。我们通过腺病毒载体感染的方法改变MSCs中TCF4的表达，并利用Boydenchamber和Dunn chamber装置检测腺病毒感染后MSCs向HGF趋化性迁移的变化。与空病毒即只含GFP的对照组相比，感染Ad-TCF4后细胞的群体迁移数目显著降低，而感染Ad-TCF4对MSCs迁移没有明显影响。Dunn chamber统计结果显示，感染Ad-TCF4组细胞的迁移速度和迁移效率都显著降低；而感染Ad-TCF4组对细胞的迁移速度和效率没有明显影响。此外，通过siRNA的方法下调MSCs中TCF4的表达也得到了与感染Ad-TCF4一致的结果，siRNA下调TCF4的表达后，MSCs向HGF迁移的速度和FMI值都显著下降。接着本文进一步研究了Wnt/β-catenin信号通路影响MSCs迁移的分子机制。基质金属蛋白酶（MMPs）是一类迁移相关蛋白，能够降解细胞外基质，促进细胞的迁移，先前的研究表明很多MMPs都是Wnt/β-catenin信号通路的靶基因，在本文中我们检测了HGF处理MSCs后MMP2、MMP7和MMP9转录水平的变化，因为这几种蛋白在肿瘤的转移中呈现较高的表达水平。结果显示HGF显著增加了MMP2的转录水平，对MMP7和MMP9的转录没有明显的影响，当MSCs感染Ad-TCF4后，HGF诱导MMP2的转录增加被抑制了，表明HGF促进MMP2的转录是通过Wnt/β-catenin信号通路完成的。由于细胞迁移与细胞骨架的重排密切相关，我们最后检测了Wnt/β-catenin信号通路在细胞骨架重排过程中的作用。通过对F-actin的免疫染色，发现HGF处理MSCs0.5min时细胞周边出现肌动蛋白聚集形成的片状伪足，且应力纤维沿着极性方向整齐排列，而抑制剂FH535处理使细胞骨架重排时间推迟，在0.5min-2min之间，细胞内部骨架散乱排布，处理5min后，部分细胞开始出现骨架的重排，说明FH535的处理，使MSCs中细胞骨架重组对HGF的敏感性下降。综上所述，Wnt/β-catenin信号通路参与了MSCs向HGF的趋化性迁移过程，并通过其下游靶基因MMP2的转录促进细胞迁移，其中TCF4是主要的转录因子，影响细胞的群体性迁移数目、迁移速度和迁移效率。本实验室前期工作发现HGF激活MSCs中PI3K和MAPKs信号通路，本实验研究表明Wnt/β-catenin信号通路也直接参与了MSCs向HGF的迁移行为，通过对这些信号通路的机制研究以及可能存在的cross-talk进行探讨，可以进一步揭示MSCs的定向迁移机制，提高MSCs靶向迁移能力，为临床应用MSCs进行干细胞移植和基因治疗提供理论基础。