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目的:伤寒沙门菌（Salmonella enterica serovar Typhi,S.Typhi）的Ⅵ型分泌系统（type 6 secretion system,T6SS）是新发现的一种分泌系统,研究发现S.Typhi的T6SS能够发挥功能且有利于细菌在巨噬细胞内的生存与增殖。本课题组前期利用蛋白组学技术,比较S.Typhi野生株（WT）和T6SS缺陷株（ΔsciG）的分泌蛋白组,发现ΔsciG菌株中T3SS-1效应蛋白SopE的分泌量明显下降。为此,本论文主要对S.Typhi T6SS是否对T3SS-1效应蛋白SopE的表达或分泌产生影响进行研究,并阐明其中的相关作用机制,以期了解S.Typhi T6SS在巨噬细胞内发挥毒力作用的机制。方法:1.构建携带sopE::Flag的S.Typhi相关菌株（1）sopE::Flag标签菌株的制备:通过自杀质粒同源重组的方法,在S.Typhi sopE基因序列末尾终止密码子前加上3×Flag标签基因序列,使WT、ΔsciG和ΔsciS中的sopE基因携带3×Flag标签。（2）回补株的制备:将pBAD33-sciG与pBAD33-sciS重组质粒分别导入携带sopE::Flag标签的ΔsciG和ΔsciS中来制备相应的回补株（C-ΔsciG、C-ΔsciS）;另将pBAD33空质粒导入携带sopE::Flag标签的WT、ΔsciG和ΔsciS来制备相对应的对照菌株（WT-pBAD33、ΔsciG-pBAD33、ΔsciS-pBAD33）。2.S.Typhi T6SS对SopE的表达调节（1）S.Typhi的WT-pBAD33、ΔsciG-pBAD33感染巨噬细胞THP-1,用qRT-PCR检测sopE基因的mRNA表达水平,western blot检测SopE的蛋白水平的变化。（2）在模拟巨噬细胞SCV内环境（LPM培养基、微需氧）的条件下,培养WT-pBAD33、ΔsciG-pBAD33和C-ΔsciG,用qRT-PCR检测sopE基因的mRNA表达水平,western blot检测SopE蛋白水平的变化。（3）将sopE基因启动子序列克隆至lac Z融合质粒pHRP309构建重组质粒pHRP309-sopE,将其分别导入WT-pBAD33、ΔsciG-pBAD33和C-ΔsciG,构建菌株WT-pBAD33/psopE、ΔsciG-pBAD33/psopE和C-ΔsciG/psopE,菌株在模拟巨噬细胞SCV内环境下进行培养,通过β-半乳糖苷酶活性检测来分析T6SS对sopE基因启动子区域表达的影响。（4）原核表达SciG蛋白:使用PCR扩增sciG基因编码区域,克隆至p ET28a质粒,转化入E.coli BL21,构建SciG蛋白表达融合菌株sciG-p ET28a-BL21。用IPTG诱导SciG蛋白的表达,Ni柱纯化SciGhis6并用PEG2000浓缩,得到纯化的SciG蛋白。（5）SciG蛋白与sopE基因的相互作用:以S.Typhi WT基因组为模板,PCR扩增sopE基因启动子区序列并纯化,以16S DNA为阴性对照。将一定量SciG蛋白与一定量基因启动子区的DNA片段共孵育,SDS-PAGE及溴化乙啶染色,用凝胶成像仪观察SciG蛋白能否直接与sopE基因启动子区域结合。3.S.Typhi T6SS对SopE分泌的影响分泌蛋白SopE western blot分析:将S.Typhi携带sopE::Flag标签的各菌株（WT-pBAD33、ΔsciG-pBAD33、ΔsciS-pBAD33、C-ΔsciG和C-ΔsciS）在模拟巨噬细胞SCV内环境下培养。离心收集细菌培养液上清,用0.22μm滤器过滤,再用Amicon（?）Ultra 10K滤器离心浓缩上清液中的蛋白,用western blot比较各菌株中T3SS-1效应蛋白SopE分泌的含量。4.构建携带sopE::Flag标签的S.Typhi T3SS-1结构invA变异株同上通过自杀质粒同源重组的方法,将pGMB151-invA重组质粒电转入携带sopE::Flag标签的WT、ΔsciG与ΔsciS制备ΔinvA、ΔinvAΔsciG、ΔinvAΔsciS（均含有sopE::Flag标签）。5.分析SopE是否可以通过T6SS分泌将携带sopE::Flag标签的WT、ΔsciG、ΔsciS、ΔinvA、ΔinvAΔsciG和ΔinvAΔsciS菌株在模拟巨噬细胞SCV内环境下培养,收集上清蛋白进行western blot,分析SopE蛋白含量,以探究SciG或T6SS在SopE的分泌途径中发挥的功能。结果:1.序列分析结果显示,成功构建携带sopE::Flag标签的S.Typhi WT-pBAD33、ΔsciG-pBAD33、ΔsciS-pBAD33、C-ΔsciG和C-ΔsciS。2.WT-pBAD33、ΔsciG-pBAD33感染巨噬细胞,qRT-PCR与western blot结果表明,ΔsciG-pBAD33中SopE的转录水平与蛋白水平较WT-pBAD33均明显下降。3.在模拟巨噬细胞SCV内环境下培养WT-pBAD33、ΔsciG-pBAD33与C-ΔsciG,qRT-PCR与western blot结果表明,与WT-pBAD33相比,ΔsciG-pBAD33中SopE的转录水平与蛋白水平均明显下降。4.β-半乳糖苷酶活性检测实验表明,在模拟巨噬细胞SCV内环境下,与WT-pBAD33相比,ΔsciG-pBAD33的sopE基因启动子转录水平明显下降。5.原核表达SciG蛋白实验,获得纯化的SciG蛋白。6.凝胶阻滞实验（EMSA）结果表明,SciG蛋白不能直接与sopE基因的启动子区域结合来调控sopE基因的转录。7.分泌蛋白western blot实验结果表明,在模拟巨噬细胞SCV内环境下,ΔsciG-pBAD33与ΔsciS-pBAD33中SopE蛋白的分泌水平较WT-pBAD33均降低。8.成功制备携带sopE::Flag标签的S.TyphiΔinvA、ΔinvAΔsciG和ΔinvAΔsciS。9.在模拟巨噬细胞SCV内环境下培养携带sopE::Flag标签的WT、ΔsciG、ΔsciS、ΔinvA、ΔinvAΔsciG和ΔinvAΔsciS,western blot实验结果显示:与WT相比,ΔsciG和ΔsciS中SopE的分泌量减少,ΔinvA中SopE的分泌量极低;在ΔinvAΔsciG和ΔinvAΔsciS中,没有检测到SopE的分泌。结论:在巨噬细胞中以及T6SS表达的条件（LPM培养基、微需氧）下,S.Typhi的T6SS促进T3SS-1效应蛋白SopE的表达。S.Typhi的T6SS功能分子SciG间接调控sopE基因的转录。在T6SS表达的条件下,S.Typhi能促进SopE通过T6SS分泌。