镰形扇头蜱唾液腺金属蛋白酶基因的克隆与生物学功能分析

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蜱是家畜家禽的一类体表寄生虫,分布广泛,可以传播多种疾病。我国目前发现的蜱种有100多种。目前控制蜱的主要手段是使用化学杀虫剂。然而,随着蜱抗药性以及畜产品的药物残留等问题的出现,寻找新的控制手段就显得尤为重要。免疫预防目前被认为是一种最有前途的控制蜱的方法。金属蛋白酶(Metalloproteinase)是活性中心依赖于金属离子的一类蛋白酶,在寄生虫中其分布非常广泛,功能涉及许多方面,某些金属蛋白酶还具有比较强的免疫原性,因此被认为是一类抗虫疫苗和药物研究的重要分子。本研究以镰形扇头蜱为研究对象,以本实验室张维谊等构建的镰形扇头蜱半饱血雌蜱唾液腺cDNA文库为基础,通过从镰形扇头蜱体内克隆出金属蛋白酶基因全长序列,并分析其的表达特点,为蜱及蜱传疾病的防治作一些基础性工作。 首先,根据已有的EST序列设计基因特异性引物GSP1:5′-CCTGAAGCCCGTGCT-3′;GSP2:5′-GCTGTCGGCCCGGTTTCTCCTC-3′;nestedGSP:5′-GCCTTCGACTTCCACGTTGTCGT-3′用于5’-RACE扩增,5’-RACE的PCR产物经纯化、连接、转化和测序。根据测序结果,设计基因特异性引物用于扩增全长基因,PCR产物经纯化、连接、转化和测序分析,结果得到全长基因序列,命名为MP。 其次,运用RT-PCR方法分析金属蛋白酶在镰形扇头蜱中的分布情况,分别提取镰形扇头蜱的各发育阶段和不同部位的总RNA,取相同的量的总RNA进行RT-PCR分析。 本文还对MP和另外一个可能为丝氨酸蛋白酶抑制剂的全长序列进行了生物信息学分析。 结果,MP全长1566bp,编码478个氨基酸,预测分子量为54580Da。结果MP在唾液腺和肠中均有表达,在各发育阶段中只在未吸血成蜱和半饱血成蜱中表达。 综上所述,本研究成功地克隆到镰形扇头蜱的金属蛋白酶基因;分析了该基因在不同的部位和发育阶段的表达情况,并且对该基因进行了比较详细的生物信息学分析,对进一步了解该基因的生理功能打下了很好的基础。同时还对丝氨酸蛋白酶抑制剂基因进行了生物信息学分析。
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