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本研究旨在分离香蕉果实炭疽病病程相关的特异表达的基因,进而推断这些基因在香蕉果实炭疽病发病过程中的作用。本实验总共分离和接种了50个炭疽菌菌株,从中筛选获得了香蕉果实炭疽菌(Colletotrichummusae)强致病菌株F1。对七到八成熟度的无炭疽菌侵染的巴西蕉果接种炭疽菌F1为处理组,同时以接种空白培养基为对照组。结果是接种炭疽菌3d未见病斑,5d病斑出现,7d病斑明显。本实验选取接种炭疽菌5d后病斑出现的香蕉果皮为Tester和对应天数的对照组为Driver,进行抑制差减杂交。用T/A法分别构建正向差减文库(含4780个克隆)和反向差减文库(含3600个克隆)。采用PCR方法筛选正向差减文库获得266个重组子,随机挑选70个重组子的cDNA插入片段进行了序列测定,并对它们进行Blastn,Blastx同源性比较。
结果表明:7个cDNA序列与数据库中功能未知的核酸序列的同源性达60-90%,约占14%;28个cDNA序列推导出的氨基酸序列与功能已知的cDNA推导出的氨基酸序列同源性达60-90%(比较的核酸长度均在200bp以上),约占54%,另外还获得未被报道过的cDNA片段5个,约为10%,它们可能代表新基因。
为了进一步了解功能推测的克隆片段有哪些涉及到抗病与防御相关基因,从克隆片段的BLASTn和BLASTx比较结果可以得出,29个克隆片段与抗病防御相关,包括几丁质酶、丝氨酸/苏氨酸激酶、异黄酮还原酶相关蛋白、富含亮氨酸重复序列、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸辅酶、类受体激酶等,这些化合物参与了抗病反应的基本过程。
对其中克隆号为T12、T710、T718、T15的cDNA片段进行Northern杂交证明分析,结果发现这些基因在被接种炭疽菌侵染前没有表达,侵染后的表达量均有不同程度的提高。同时说明所克隆到的差异表达的cDNA片段确实是香蕉基因组所编码的,并且是接种炭疽菌后菌丝与果皮开始互作时到5d病斑出现这一病程表达的。另外,揭示这些基因在病原与寄主互作中起着不同的作用。从而也证实了SSH中获得的cDNA基因片段的正确性。
本研究采用SSH方法构建了炭疽菌侵染香蕉果实早期果实内部特异表达基因的差减文库,并进行了基因功能的推断。获得了部分抗病相关基因片断,为下一步的研究提供了基础。