论文部分内容阅读
目的:糖尿病可以导致认知功能障碍,成为目前研究的热点。研究表明氧化应激是糖尿病认知功能障碍的重要发病机制之一,NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)在氧化应激中起中枢作用。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA),是检验体内氧化应激水平的重要指标。丁苯酞可以改善糖尿病认知功能障碍,但其具体机制尚不十分清楚。本实验旨在对糖尿病db/db小鼠预防性应用丁苯酞,观察丁苯酞对糖尿病db/db小鼠认知功能及其海马组织中SOD、MDA及NADPH氧化酶p67phox亚基、gp91phox亚基的影响。方法:1分组6周龄雄性db/m小鼠8只作为正常对照组(NC,n=8只)。雄性db/db小鼠16只,随机分为糖尿病对照组(DM-C,n=8只),糖尿病丁苯酞组(DM-NBP,n=8只)。2药物干预实验动物适应性喂养1周后,给予DM-NBP组小鼠丁苯酞灌胃(丁苯酞剂量为120mg/Kg/d),NC组及DM-C组小鼠给予等量的植物油灌胃,每日1次,连续干预6周。3一般观察每周监测各组小鼠的血糖、体重变化。观察各组小鼠的精神状态、进食情况、摄水量及尿量等一般情况。4行为学检测丁苯酞干预6周后,进行水迷宫测试,分析各组小鼠学习、记忆能力。包括连续5天的定位航行实验,记录各组小鼠的逃避潜伏期,于第6天进行空间探索实验,记录各组小鼠穿越平台次数。5 ELISA、Western-Blot、Real Time PCR检测水迷宫实验结束后,处死各组小鼠,取其海马组织,应用酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测SOD与MDA的含量。蛋白免疫印迹法(Western-Blot,WB)检测NADPH氧化酶p67phox亚基、gp91phox亚基蛋白的表达。实时荧光定量-聚合酶链反应(Real Time Polymerase Chain Reaction,Real Time PCR)检测NADPH氧化酶p67phox亚基、gp91phox亚基m RNA的表达水平。6统计学方法实验数据应用SPSS 21.0统计软件进行统计分析,数据描述用均数±标准差(x±s)表示,应用完全随机设计的单因素方差分析、重复测量方差分析进行数据统计,三组间两两比较应用SNK-q检验,P<0.05表示差异有统计学意义。结果:1一般情况NC组小鼠精神状态良好,皮毛光顺,进食水量、尿量正常。DM-C组及DM-NBP组小鼠出现多尿、多饮、多食症状,毛发稀疏无光泽,精神萎靡。干预过程中,DM-NBP组小鼠一般情况优于DM-C组。丁苯酞干预6周后,测定各组小鼠体重(g)。结果显示,与NC组(26.39±1.66)相比,DM-C组(58.06±2.38)与DM-NBP组(57.34±2.17)小鼠体重显著增加(P<0.05)。与DM-C组相比,DM-NBP组小鼠体重无明显差异(P>0.05)。丁苯酞干预6周后,取尾静脉血测定各组小鼠的血糖(mmol/L)。结果显示,与NC组(7.21±0.91)相比,DM-C组(20.94±1.71)与DM-NBP组(20.03±1.66)小鼠血糖明显升高(P<0.05)。与DM-C组相比,DM-NBP组小鼠血糖无显著差异(P>0.05)。2行为学观察:Morris水迷宫测试2.1基础游泳速度测定(cm/s)实验开始前,为排除个体差异,让各组小鼠自由游泳60s,测定基础游泳速度。结果显示NC组(138.33±7.40)、DM-C组(134.70±8.28)与DM-NBP组(136.64±7.14)三组小鼠间基础游泳速度无显著差异(P>0.05)。2.2逃避潜伏期测定(s)定位航行第1天,各组小鼠间逃避潜伏期无明显差异(P>0.05)。第2-5天,与NC组相比,DM-C组与DM-NBP组小鼠逃避潜伏期均明显延长(P<0.05);与DM-C组相比,DM-NBP组小鼠逃避潜伏期明显缩短(P<0.05)。各组小鼠随着天数增加逃避潜伏期逐渐缩短:Day1>Day2>Day3>Day4>Day5。2.3空间探索实验:穿越平台次数(次/60 s)与NC组(7.00±0.76)相比,DM-NBP组(5.13±0.64)、DM-C组(2.38±0.52)小鼠穿越平台次数均明显减少(P<0.05)。与DM-C组相比,DM-NBP组小鼠穿越平台次数明显增加(P<0.05)。3 Real Time PCR结果NADPH氧化酶p67phox亚基m RNA的表达:与NC组(0.686±0.015)相比,DM-C组(1.003±0.026)、DM-NBP组(0.802±0.023)小鼠海马组织中NADPH氧化酶p67phox亚基m RNA的表达水平均明显升高(P<0.05)。与DM-C组相比,DM-NBP组小鼠海马组织中NADPH氧化酶p67phox亚基m RNA的表达水平明显降低(P<0.05)。NADPH氧化酶gp91phox亚基m RNA的表达:与NC组(0.629±0.054)相比,DM-C组(1.020±0.019)、DM-NBP组(0.784±0.020)小鼠海马组织中NADPH氧化酶gp91phox亚基m RNA的表达水平均明显升高(P<0.05)。与DM-C组相比,DM-NBP组小鼠海马组织中NADPH氧化酶gp91phox亚基m RNA的表达水平明显降低(P<0.05)。4 WB结果NADPH氧化酶p67phox亚基蛋白的表达:与NC组(0.574±0.055)相比,DM-C组(1.310±0.019)、DM-NBP组(1.071±0.023)小鼠海马组织内NADPH氧化酶p67phox亚基蛋白的表达均明显增强(P<0.05)。与DM-C组相比,DM-NBP组小鼠海马组织内NADPH氧化酶p67phox亚基蛋白的表达明显减弱(P<0.05)。NADPH氧化酶gp91phox亚基蛋白的表达:与NC组(0.690±0.028)相比,DM-C组(1.516±0.024)、DM-NBP组(1.258±0.026)小鼠海马组织中NADPH氧化酶gp91phox亚基蛋白的表达明显增强(P<0.05)。与DM-C组相比,DM-NBP组小鼠海马组织中NADPH氧化酶gp91phox亚基蛋白的表达明显减弱(P<0.05)。5 ELISA结果SOD含量(ng/ml):与NC组(112.311±3.078)相比,DM-C组(43.602±1.808)、DM-NBP组(51.544±1.482)小鼠海马组织中SOD含量均明显降低(P<0.05)。与DM-C组相比,DM-NBP组小鼠海马组织中SOD含量明显升高(P<0.05)。MDA含量(pg/ml):与NC组(0.858±0.047)相比,DM-C组(1.353±0.111)、DM-NBP组(1.024±0.043)小鼠海马组织中MDA的含量均明显升高(P<0.05)。与DM-C组相比,DM-NBP组小鼠海马组织中MDA的含量明显降低(P<0.05)。结论:1 13周龄的糖尿病db/db小鼠学习、记忆能力明显下降。2丁苯酞可以改善糖尿病db/db小鼠学习、记忆能力。3 13周龄的糖尿病db/db小鼠海马组织中MDA的含量增加,SOD的含量降低,提示氧化应激水平增强,抗氧化应激能力减弱。其中在氧化应激反应中起中枢作用的NADPH氧化酶的亚基p67phox与gp91phox的蛋白及m RNA表达增强。4丁苯酞可以增加SOD含量,降低MDA含量,降低NADPH氧化酶p67phox亚基及gp91phox亚基的m RNA及蛋白的表达。考虑丁苯酞通过降低氧化应激反应,提高抗氧化应激能力,从而改善糖尿病认知功能障碍。