微生物的发酵作用改变了豆制品的风味和质地,也丰富了豆制品的生物活性成分及生理功能。毛豆腐是由毛霉诱导发酵的豆制品。本研究分析毛豆腐发酵过程中大豆异黄酮,大豆皂苷和γ-氨基丁酸等重要植物化学成分的变化,确认毛豆腐提取物潜在的免疫活性。为毛豆腐的促健康作用增添又一有力证据,同时,为大力发展功能性发酵豆制品和拓展发酵豆制品的应用领域奠定科学依据。本研究从自然发酵的毛豆腐中分离筛选出毛霉菌株,制成孢子悬液并接种于灭菌的豆腐,在20°C发酵7 d,分别于3、4、5、6、7 d随机取样。考察在此发酵过程中水分、蛋白质、异黄酮、皂苷、γ-氨基丁酸、β-葡萄糖苷酶和谷氨酸脱羧酶的变化。采用p H 6.5的水、p H 4.5水、80%乙醇溶液和40%乙醇溶液对发酵3~7d的毛豆腐进行提取。考察所获得的20个提取物对免疫细胞的体外激活作用,分别以T淋巴细胞增殖作用、巨噬细胞吞噬能力、d然杀伤(NK)细胞活性以及淋巴细胞和巨噬细胞所分泌的细胞因子为评价指标,筛选出体外免疫刺激活性较高的水提取物和乙醇提取物。随后考察p H 6.5水提取物和80%乙醇提取物对脂多糖(LPS)诱导的炎性RAW264.7细胞的调控作用。最后,以BABL/c小鼠为动物模型,分别考察毛豆腐提取物在高、中、低剂量下对正常模式和免疫抑制模式小鼠的免疫功能的影响。分析实验结果显示,在毛豆腐发酵过程中,水分含量随发酵时间的延长而显著降低,蛋白质含量相对升高。高效液相色谱分析显示,发酵过程中大豆苷和染料木苷的含量分别减少39.65%和32.94%,而大豆苷元和染料木素分别增加29.48%和25.69%;苷元与糖苷的比例从1.31增加到2.59。大豆皂苷Ab含量从0.75 g/kg减少到0.51 g/kg,而γ-氨基丁酸含量从3.81g/kg增加到5.09g/kg。同时,β-葡萄糖苷酶酶性由8.58 U/g增加到11.65 U/g,谷氨酸脱羧酶酶性由5.91 U/g增加到10.94 U/g。2随发酵时间的延长,各提取物中蛋白质的含量也逐渐增加,表明蛋白质水解作用增加,可溶性多肽增多;其中p H 6.5水提取物的蛋白质含量最高,80%乙醇溶液的蛋白质含量最低。细胞实验结果显示,在发酵过程中,所有提取物均可增强T淋巴细胞的体外增殖、NK细胞的杀伤活性以及巨噬细胞的吞噬功能,同时,可显著提高淋巴细胞因子IL-2、IFN-γ和巨噬细胞细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌水平,以及增强诱导型一氧化氮氧合酶和溶菌酶的酶活性,降低淋巴细胞因子IL-4的分泌水平。发酵至第6d时各提取物的免疫活性最高,p H 6.5水提取物好于p H4.5水提取物,而80%醇提取物好于40%醇提取物。另外,在RAW264.7细胞中,p H 6.5水提取物和80%醇提取物还可显著降低LPS诱导的高水平炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TFN-α以及PGE2和COX2表达,显著提升抗炎因子IL-10的分泌水平。动物实验结果显示,在正常模型小鼠中,毛豆腐提取物可提高免疫器官指数,增强T淋巴细胞增殖功能,NK细胞杀伤活性以及巨噬细胞吞噬功能,升高小鼠血清中免疫球蛋白Ig G、Ig M、Ig A以及补体C3、C4的表达水平,提高介导细胞免疫应答的Th1细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4的分泌水平,降低介导体液免疫应答的Th2细胞因子IL-5、IL-10的分泌水平。此外,毛豆腐提取物还可提高血清溶血素HC50值。各项指标数值显示出显著的剂量依赖关系。在免疫抑制小鼠模型中,毛豆腐提取物可缓解环磷酰胺造成的免疫抑制效果,降低脾脏组织损伤,延缓细胞功能的衰弱,回调各免疫分子的分泌水平。整体研究结果表明,在毛豆腐的纯种毛霉发酵过程中,由于毛霉产生β-葡萄糖苷酶和谷氨酸脱羧酶,一些重要的植物化学成分(异黄酮、皂苷、γ-氨基丁酸)发生显著变化。同时,由于蛋白酶的产生,大豆蛋白发生降解,毛豆腐提取物显示出较好的免疫活性,可体外激活淋巴细胞和巨噬细胞,通过激活细胞免疫应答方式增强正常小鼠的免疫功能,同时,对于免疫抑制小鼠通过调节细胞免疫应答方式改善其免疫功能。所以,毛豆腐是一种具有免疫增强活性的发酵豆制品。