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目前我国大约有600万阿尔茨海默氏病(Alzheiemer’s disease,AD)患者,而且每年以30万人的数量增长。目前关于AD的发病机制尚不完全清楚,有效的治疗方法也非常有限。虽然淀粉样蛋白斑块沉积和tau蛋白过度磷酸化是AD脑组织最为典型的病理改变,但是对于造成这种病理变化的原因和神经元内部的调控机制尚不完全清楚。miRNA(micro RNA,miRNA)是近年发现的基因表达调控因子。研究发现,AD患者脑内存在大量而复杂的miRNA的改变,在AD的发生发展过程中发挥重要作用。本研究前期工作中,我们通过检索人类AD脑组织miRNA表达数据集GSE16759,并应用统计学分析miRNA基因芯片结果,发现miRNA 369(miR-369)在AD患者脑组织中表达明显下降,并且miR-369是一个高度保守的miRNA,其碱基序列在人类和小鼠中显示出100%的一致性。因此,本研究探讨miR-369表达下调对AD小鼠认知障碍和脑内tau蛋白磷酸化的影响及其制。第一部分3xTg-AD小鼠脑内miR-369的表达和认知行为改变目的:证实3xTg-AD小鼠脑内miR-369表达下调,为研究miR-369在AD发生发展中的作用奠定基础。方法:应用实时定量PCR技术,观察对比正常小鼠(野生C57小鼠)与3xTg-AD小鼠大脑皮质内miR-369表达水平。采用Morris水迷宫和Barnes迷宫观察对比正常小鼠与3xTg-AD小鼠行为认知能力的变化。结果:3xTg-AD小鼠中,6月龄时其大脑皮质中miR-369的表达与2月龄相比明显降低;野生C57小鼠中,6月龄时大脑皮质中miR-369的表达水平与2月龄相比无明显变化。此外6月龄3xTg-AD小鼠大脑皮质miR-369的表达水平也明显低于同龄的野生C57小鼠。Morris水迷宫和Barnes迷宫测试表明,6月龄3xTg-AD小鼠认知能力明显低于野生C57小鼠,与mi-369表达下调时间点一致。结论:3xTg-AD小鼠大脑皮质内miR-369表达随年龄增长明显下调;伴随miR-369表达下调,其认知能力出现障碍。第二部分miR-369靶向调控Fyn和SRPK2激酶的表达和tau蛋白磷酸化目的:观察miR-369是否可以通过靶向性结合Fyn或者SRPK2的3’-UTR端调节其基因表达,进而影响tau蛋白磷酸化水平。方法:通过在线miRNA靶基因分析数据库预测miR-369的潜在靶基因。采用荧光素酶报告实验,将预测靶基因的3’-UTR端与荧光素酶基因连接后和miR-369共转染进入293T细胞,检测转染后细胞内荧光水平,确定miR-369是否可以靶向性结合Fyn或者SRPK2的3’-UTR端调节其基因表达。体外培养小鼠神经母细胞瘤细胞系neuro-2a,采用转染质粒或干扰miRNA(si RNA)分别上调和沉默miR-369及其靶基因表达,应用实时定量PCR和Western blot方法检测miR-369及其靶基因和蛋白表达和tau蛋白磷酸化水平。结果:在线miRNA靶基因分析,发现miR-369可以序列互补性结合Fyn或者SRPK2基因的3’-UTR端,提示Fyn和SRPK2均可能成为miR-369的靶基因。荧光素酶报告实验显示,共转染miR-369显著降低了Fyn和SRPK2荧光素酶报告体系的荧光水平,提示miR-369可以靶向性结合Fyn或者SRPK2的3’-UTR端调节其基因表达。转染miR-369质粒后,细胞内miR-369的表达明显升高,Fyn和SRPK2的m RNA和蛋白表达水平均显著下降,tau蛋白磷酸化水平明显降低;转染si RNA沉默miR-369表达后,细胞内tau蛋白磷酸化水平明显升高;转染si RNA沉默Fyn或者SRPK2激酶后,细胞中tau蛋白的磷酸化水平显著降低。结论:Fyn和SRPK2都是miR-369的靶基因,miR-369能够分别结合这两个基因的3’-UTR端,并抑制其表达,进而抑制tau蛋白磷酸化。第三部分调制脑内miR-369对3xTg-AD小鼠认知功能和脑内tau蛋白磷酸化水平的影响及其机制目的:观察调制脑内miR-369对3xTg-AD小鼠认知功能和脑内tau蛋白磷酸化水平的影响及其机制,探讨miR-369在AD发生发展中的作用。方法:应用基因敲除和杂交技术,制备敲除miR-369的3xTg-AD小鼠。采用水迷宫和Barnes迷宫试验检测该小鼠认知功能的变化。通过脑室注射方法,给敲除miR-369的3xTg-AD小鼠补充外源性miR-369上调其表达和功能。采用实时定量PCR、Western blot和免疫组织化学方法观察该小鼠大脑皮质中Fyn、SRPK2以及tau蛋白磷酸化水平的改变。结果:Morris水迷宫和Barnes迷宫测试结果显示,敲除miR-369的3xTg-AD小鼠认知能力和记忆能力明显下降。实时定量PCR、Western blot和免疫组化结果显示,敲除miR-369的3xTg-AD小鼠大脑皮质Fyn和SRPK2激酶的水平显著增加,tau的磷酸化水平明显升高,而总tau蛋白表达没有明显改变。给敲除miR-369的3xTg-AD小鼠补充miR-369后,大脑皮质miR-369表达明显升高,Fyn和SRPK2表达水平明显减少,tau蛋白磷酸化水平明显下降。结论:miR-369缺失通过增加Fyn和SRPK2表达,加剧AD鼠大脑皮质内tau蛋白的磷酸化,促进AD鼠认知障碍的发生发展。