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目的:组织蛋白酶D(Cathepsin D,Cath-D)是一种酸性溶酶体的蛋白水解酶,在pH2.8~5.0范围内能降解有结构、功能的蛋白质、多肽、肽前体及激素。此外,该酶在多种组织的重构、改建和凋亡中亦具有重要活性作用。近年来许多研究发现Cath-D表达水平改变与多种肿瘤细胞(乳腺癌、卵巢癌、人神经胶质瘤、喉癌、肺癌、肠癌、白血病、淋巴瘤等)的增殖和凋亡密切相关。本文旨在探讨Cath-D在人淋巴瘤细胞株Raji中的表达水平变化对Raji细胞增殖和阿霉素(Adriamycin,ADM)敏感性的影响。方法:1.细胞株及细胞培养人淋巴瘤细胞株Raji购自上海生物化学与细胞生物学研究所,用含10%胎牛血清的1640培养基在37℃、5%CO2的温箱内培养,2~3d传代1次,实验时取对数生长期细胞。2.研究方法将对数生长期Raji细胞分为5组:①空白对照组,即Raji细胞未作任何处理;②二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)对照组;因实验用胃酶抑素A(Pepstatin A,PepA)溶于有机溶剂DMSO,故设立等量DMSO对照组;③PepA处理组,单用100μmol/L PepA处理Raji细胞16h;④ADM处理组,单用3.15μg/mL(48hADM的半数抑制浓度(50%inhibiting concentration,IC50))处理Raji细胞48h;⑤PepA+ADM处理组,即Raji细胞先与100μmol/L PepA预培养16h,再用3.15μg/mLADM处理48h。四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测不同密度Raji细胞的增殖曲线,据此选取适宜用来进行48h内Raji细胞的增殖活性测定的细胞密度。MTT法测定细胞增殖抑制率,以ADM的48h IC50作为本实验的工作浓度。Western blot法检测ADM处理前后各组Raji细胞Cath-D表达水平的变化。MTT法检测用PepA预处理后,Raji细胞对ADM敏感性的变化。3.统计学处理所有数据均用DPS V3.11专业版软件分析。数据采用(?)±s、百分率表示,多组间均数比较采用方差分析,两组间均数比较采用t检验,两参数间的相关性采用Spearman等级检验。结果:1、在72h之内,细胞密度为1×103~5×104/mL范围内,随时间延长,细胞呈线性关系生长(图1)。细胞悬液密度为5×103/mL时,72h内MTT测定的OD值在可信区间范围内,且与时间呈良好的线性关系,适宜用来进行48h内Raji细胞的增殖活性测定。2、ADM工作浓度浓度为1、2、4、8、16μg/mL的ADM作用于Raji细胞48h后的抑制率分别为(17.59±4.26)、(44.20±6.05)、(64.61±2.52)、(73.82±3.32)和(79.36±1.21)%。48h ADM的IC50为3.15μg/mL,并以此药物浓度为工作浓度进行各项实验。3.光学显微镜下细胞形态学变化光学显微镜结果显示正常培养条件下Raji细胞为饱满的圆形,悬浮生长,突起较少,胞体透亮,折光性好,胞内颗粒较少,相邻细胞生长融合成片,生长状态良好。经ADM处理后,胞体内颗粒逐渐增多,细胞间连接消失,胞体变大或收缩、出泡,细胞核高度凝聚,或者碎裂呈梅花样,细胞形态变得模糊,不完整,有的可见凋亡小体形成,随着作用浓度增高,凋亡细胞数增多,凋亡形态更明显(图2、图3)。4、处理前后各组Cath-D表达水平变化Cath-D在Raji细胞中有表达,与空白对照组相比,DMSO对照组的Cath-D表达水平无明显变化,PepA处理组和PepA+ADM处理组的Cath-D表达均有下降,两组的下降程度无统计学差异(P<0.05);而单用ADM处理组Raji细胞中Cath-D表达增高(P<0.05)。5、Cath-D对Raji细胞增殖的影响MTT结果显示,DMSO对照组和单用PepA处理组,Raji细胞增殖均无变化,而ADM处理组及PepA+ADM处理组均明显抑制Raji细胞增殖,且PepA+ADM处理组的细胞增殖抑制率显著低于ADM处理组(P<0.05)。结论:1.与空白对照组相比,DMSO对照组Cath-D表达水平和Raji细胞增殖均无变化(P<0.05),证明本实验所用剂量的有机溶剂DMSO对实验结果无明显影响。PepA处理组和PepA+ADM处理组的Cath-D表达均有下降,表明本实验所用剂量的PepA能有效抑制Cath-D表达。2.与空白对照组相比,PepA处理组Cath-D表达下降,但该组Raji细胞增殖无变化(P<0.05),提示在无化疗药ADM作用下,Cath-D表达水平变化对细胞增殖和凋亡无影响;3.与空白对照组相比,PepA+ADM处理组的Cath-D表达下降,ADM处理组Raji细胞Cath-D表达上调;而ADM处理组及PepA+ADM处理组均明显抑制Raji细胞增殖,且PepA+ADM处理组的细胞增殖抑制率显著低于ADM处理组(P<0.05)。提示Cath-D可能参与ADM介导的Raji细胞的凋亡,并能增强Raji细胞对ADM的化疗敏感性。Cath-D可能为肿瘤基因治疗的一个理想的靶标。