研究目的:病毒性心肌炎（Viral myocarditis,VMC）是临床上最常见的感染性心肌病,它是由嗜心性病毒感染所引起的心肌细胞变性、坏死和间质炎性细胞浸润以及纤维渗出等为主要改变的心肌疾病,可进一步并发严重的心律失常、心力衰竭、心源性休克甚至猝死,亦可演变为扩张型心肌病。导致病毒性心肌炎的病毒中,最为主要是柯萨奇B组病毒（CVB）,在CVB的六个血清分型中,CVB3具有强嗜心性,所以,近来开展的各项研究主要是针对以CVB3感染所建立的病毒性心肌炎模型。因为VMC自身具有极高的危害性,所以本课题选择病毒性心肌炎作为研究的主要对象,由于小儿及成人的各个年龄段均可感染患病,急性期后,又有可能进一步演变为扩张型心肌病,并且VMC还可引起小范围的爆发流行,特别是近年来病毒性心肌炎的发病率更是呈现上升态势,所以,针对CVB₃病毒性心肌炎的治疗机制的研究更加显得尤为重要。本研究是在中医脏腑理论学说及伤寒、温病学说等研究的基础上,结合多年的临床诊治经验,发现“气虚血瘀”是病毒性心肌炎发生的主要内在因素,并据此精心筛选出由黄芪、白参、郁金、丹参、麦冬等药组成的益气活血中药复方来治疗病毒性心肌炎,具有显著的抗心律失常和减轻心肌损伤等作用,但该中药复方的具体作用机制尚不明确。因此,本研究拟建立CVB3心肌细胞感染模型,利用改良的抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization ,SSH）等分子生物学技术,来探讨受CVB₃攻击的宿主细胞中与益气活血中药复方观察组中趋化因子CXCL12、Sash1、small inducible cytokine A2、ribosomal protein S4基因的表达变化,以期进一步从基因水平揭示益气活血中药复方调控VMC的作用靶标和途径信息,为深入研究该方在病毒性心肌炎治疗过程中所具有的生物学效应和意义提供新的理论基础和实验依据,从而进一步证实益气活血法是治疗病毒性心肌炎的有效方法,益气活血中药复方是治疗CVB₃病毒性心肌炎的有效方剂。材料与方法:1实验材料1.1实验动物新生2-3天wistar乳鼠（辽宁中医药大学实验动物中心负责提供）。1.2实验药品及相关试剂特级胎牛血清（灏洋生物,天津）、高糖DMEM（Gibco,美国）、硫酸链霉素（美罗大药厂,大连）、青霉素钠（华北制药股份有限公司,石家庄）、碳酸氢钠（天津市氨基酸公司,天津）、MTT（Sigma,美国）、胰蛋白酶（Invitrogen,美国）、DMSO（Sigma,美国）、PBS（博士德,武汉）等。ANT（santa,美国）、PFP（santa,美国）、α-MHC（abcam,美国）、DAB显色试剂盒（博士德,武汉）、SABC免疫组化（过氧化物酶）试剂盒（博士德,武汉）、Triton X-100（Solarbio,北京）、抗原修复液（博士德,武汉）。2实验方法2.1益气活血中药复方的细胞毒性测定:把复苏的Hela细胞提取出来,然后经培养瓶传代,接种到96孔的细胞培养板中,每孔0.2ml,放置于37℃,5%二氧化碳培养箱中进行培养,当出现呈单层贴壁生长的Hela细胞时,测量益气活血中药复方的最大无毒剂量。将益气活血中药复方注射液用DMEM培养液从原液开始配制成11个浓度。每个浓度设置4个复孔,每孔0.2ml,另外设4个对照孔加入正常的生长液。观察细胞生长状态（分别于24h和48h）,参考正常对照孔的细胞形态,最大无毒剂量（TD0）是以不引起细胞病变的最大药物稀释浓度。2.2 CVB₃病毒毒力滴定:在96孔的培养板中制备单层生长的Hela细胞,弃掉生长液,并且各培养孔用HBSS液洗涤2次。将CVB₃病毒以10倍浓度从10-1用含2%胎牛血清的维持液稀释到10-8,接种于96孔的培养板中,每孔0.1ml,每个浓度设4个复孔,另外设4个正常孔对照,每孔加入0.1ml维持液,放置于37℃,5%二氧化碳培养箱中进行培养,观察细胞的病变情况（分别于24h和48h）。2.3益气活血中药复方对CVB₃所致心肌细胞死亡的抑制实验（MTT法）:将50%组织感染量浓度的CVB₃病毒与提取后的对数生长期心肌细胞混合0.2ml/孔,吸附心肌细胞2h。在加入含有益气活血中药复方的生长液之前,需保证该生长液已被稀释8个浓度。核算方法以药物最大无毒剂量为标尺。4个复孔对应一个浓度,在剂量上,设置值为0.2ml/孔,每个浓度还设有1个调零孔。DMEM培养液需在四十八个小时之后才能添加,剂量为0.18ml/孔,一切就绪后,方可放入MTT溶液0.02ml。另外MTT溶液需要再在培养箱中一定时限,即4小时。吸弃孔内培养液,加入DMSO,每孔0.15ml,置于振荡器上,振荡8min,在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值（OD）。2.4益气活血中药复方对CVB₃病毒性心肌炎心肌细胞趋化因子CXCL12、SASH1、MCP-1、Rps4基因表达的影响:利用改良的抑制性消减杂交技术（suppression subtractive hybridization,SSH）,分离益气活血中药复方观察组和大鼠心肌细胞CVB₃感染组差异表达的基因,并通过荧光RT-PCR对上述结果进行验证。3实验结果:3.1CVB₃病毒毒力滴定:50%培养细胞CVB₃病毒感染量为1×10^-4.5。3.2益气活血中药复方细胞毒性测定:益气活血中药复方的最大无毒浓度是7.813mg/ml。3.3益气活血中药复方对CVB₃所导致的心肌细胞死亡的抑制实验（MTT法）:CVB₃攻击后的心肌细胞被益气活血中药复方最大无毒剂量干预时,其吸亮度值也最大,和其他稀释度组相比,差异显著,（P<0.0010）,从而可以证实益气活血中药复方的最大无毒剂量具有显著的抑制CVB₃所致心肌细胞死亡的作用。3.4益气活血中药复方对CVB₃病毒性心肌炎心肌细胞趋化因子CXCL12、SASH1、MCP-1、Rps4基因表达的影响:改良的SSH结果显示益气活血中药复方观察组中趋化因子CXCL12、SASH1、MCP-1、Rps4基因的表达比CVB₃病毒组中高,这一结果通过荧光RT-PCR得到验证。实验结论:1.利用体外培养的方法,成功建立了被CVB₃攻击的新生乳鼠原代心肌细胞的感染模型。2.通过观察益气活血中药复方对CVB₃病毒性心肌炎心肌细胞趋化因子CXCL12、SASH1、MCP-1、Rps4基因表达的影响,进一步证实了以益气活血药为主组成的中药复方,具有多靶点、多层面和多作用的效果。3.本课题从更深层次论证了益气活血法对病毒性心肌炎疗效的确切性,而益气活血中药复方是诊治病毒性心肌炎的有效方剂,揭示本方在VMC的治疗中具有广阔的应用前景。