【摘 要】
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非生物胁迫是水稻生长发育及产量的主要限制因素,因此非生物胁迫相关基因的发掘及功能鉴定对于水稻品种抗性改良至关重要。研究表明反应调节因子RR家族蛋白通过脱落酸（ABA）信号通路广泛参与植物非生物胁迫调控,但水稻中研究较少。本研究通过生物信息学分析了RR家族的基因特征。基于CRISPR/Cas9基因编辑技术成功创制了盐胁迫响应基因,即水稻RR家族基因SSRP（Salt-sensitive RR Pro
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非生物胁迫是水稻生长发育及产量的主要限制因素,因此非生物胁迫相关基因的发掘及功能鉴定对于水稻品种抗性改良至关重要。研究表明反应调节因子RR家族蛋白通过脱落酸（ABA）信号通路广泛参与植物非生物胁迫调控,但水稻中研究较少。本研究通过生物信息学分析了RR家族的基因特征。基于CRISPR/Cas9基因编辑技术成功创制了盐胁迫响应基因,即水稻RR家族基因SSRP（Salt-sensitive RR Protein,LOC＿Os08g35670）的ssrp纯合突变体,并分析了靶位点突变效率,突变体的类型及特征。最后对ssrp突变株系进行了高盐胁迫抗性鉴定。得到以下结果:1.在水稻中鉴定得到31个含REC结构域的RR家族成员。根据序列比对和保守基序分析,将其分为三大类:只含REC结构域的A类,除REC结构域外还具有转录激活功能结构域的B类以及具有CCT结构域的C（PRR）类。启动子序列分析得知SSRP具有ABRE、CGTCA-motif和TGACG-motif等与胁迫及激素响应相关的关键顺式作用元件。表达模式分析表明SSRP基因特异性的在子房中表达,而在其他部位几乎不表达。共线性分析揭示了RR家族扩张来源于种间和种内共同的片段复制和基因串联复制。2.通过CRISPR/Cas9技术定向敲除了SSRP基因。在位于SSRP第三个外显子也是REC结构域所在位置设计了两个靶点,用于构建Cas9-SSRP载体,转化Nip获得9株阳性T0代突变株系。靶点T1和T2突变效率分别为44.44%和88.88%。双等位突变和纯合突变居多。突变类型最多的为碱基缺失。突变位置最常见的是PAM结构上游第3和第4碱基处。其后代基因型分离比符合孟德尔定律,为可遗传突变。检测了4个T1代SSRP基因敲除株系KO1～4,大多表现为因碱基缺失导致氨基酸移码突变。ssrp突变株中SSRP基因表达量显著下降。农艺性状调查表明突变株的产量性状均有所下降。3.构建p1305-SSRP-GFP融合表达载体转化水稻原生质体通过Confocal进行荧光观察,亚细胞定位结果表明SSRP属于核定位蛋白。SSRP基因的表达受盐、干旱胁迫和激素诱导。KO株系T2代种子及幼苗的盐胁迫分析显示ssrp突变株对盐敏感。盐胁迫处理后,RT-q PCR检测了盐响应基因的相对表达量,发现显著下调的基因有Os MADS25、Os JAMyb、Os PYL5LRC和Os MSR2,均与ABA信号通路相关,暗示SSRP通过ABA调控网络适应非生物胁迫。
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