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研究目的:本课题采用体外、体内化学性肝损伤模型进行药效学试验,观察木蹄复方水提物(aqueous extract from Fomes Fomentarius compound,AEFFC)对四氯化碳(CCl4)所致肝损伤的保护作用,并初步探讨其作用机理,同时观察AEFFC对小鼠的急性毒性反应,以初步评价其安全性,希望为AEFFC在肝损伤性疾病的防治提供实验依据,推动其在临床上更为广泛的应用。研究方法:1、AEFFC对四氯化碳致L-02肝细胞损伤的保护作用(1)L-02体外肝损伤模型的建立:用不同浓度的CCl4作用L-02肝细胞,24h后,MTT法检测细胞活性,确定CCl4造模的最佳浓度;(2)细胞实验分为六组:CCl4模型组(终浓度为20mmol/L)、AEFFC(50、100、200μg/ml)+CCl43个处理组、空白对照组、维生素E(终浓度为50mmol/L)+CCl4组,每组设8个复孔;(3)通过MTT法检测细胞活性;(4)通过分光光度法测定细胞培养上清液中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的活性;(5)测定细胞内丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活力。2、AEFFC对小鼠CCl4急性肝损伤的保护作用(1)建立小鼠急性肝损伤模型:采用CCl4制备小鼠急性肝损伤模型,将小鼠随机分为6组,分别为正常对照组、模型组、不同浓度AEFFC组(100、200、400mg/kg)和联苯双酯滴丸(BDP)阳性对照组(150mg/kg),每组10只。灌胃给药,正常组及模型组给予蒸馏水,其它各组分别给予相应剂量药物,1d/次,连续7d。末次给药后2h,模型组及各给药组均腹腔注射0.1%CCl4植物油溶液10mL/kg,而正常组腹腔注射不含CCl4植物油10mL/kg,制备小鼠急性肝损伤模型。禁食(不禁饮)18h;(2)分离血清,检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的活性变化以及TNF-α的含量;(3)取肝脏组织,HE染色作病理检查;(4)TUNEL法检测肝组织凋亡细胞比率;(5)检测肝组织匀浆MDA、SOD的含量;(6)实时荧光定量PCR方法检测TNF-α mRNA的表达。3、急性毒性试验将40只小鼠随机分成AEFFC组和空白对照组,每组20只。AEFFC组小鼠用最大浓度0.48g/mL、最大体积0.25mL/10g药物,上下午各一次灌胃。空白对照组灌胃等体积的蒸馏水。给药后连续观察14d,详细记录小鼠活动情况及死亡数量。实验结束时,将动物全部处死,解剖,肉眼观察其主要脏器组织病变情况,计算MTD。结果:1、AEFFC对四氯化碳致L-02肝细胞损伤的保护作用(1)建立了L-02体外肝损伤模型:随着CCl4浓度的升高,L-02肝细胞存活率逐渐下降,我们采用20mmol/L CCl4作用24小时作为L-02肝细胞的损伤模型;(2)AEFFC明显改善四氯化碳处理L-02肝细胞的形态:细胞形态学观察结果显示,各AEFFC组细胞生长状况明显优于四氯化碳处理模型组,且各剂量组随着浓度的递增,呈现明显的剂量效应关系,细胞皱缩的程度减轻,结构逐渐清晰,脱落减少;(3)AEFFC对CCl4损伤L-02肝细胞培养上清液中转氨酶具有显著的降低作用:与正常对照组相比,模型组转氨酶明显升高,各AEFFC组的ALT、AST除50μg/mL的AST与模型对照组无显著差异外(P>0.05),其余各剂量组的转氨酶均明显降低;(4)AEFFC显著降低CCl4损伤L-02肝细胞MDA含量,提升SOD活性:CCL4损伤后模型组肝细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性明显降低,丙二醛(MDA)含量明显升高,各AEFFC组的MDA、SOD除50μg/mL的MDA与模型对照组无显著差异外,其余剂量组都能显著提高CCl4损伤后肝细胞中的SOD活力,降低CCl4损伤后肝细胞中的MDA水平;(5)AEFFC显著提高CCl4损伤L-02肝细胞的存活率:CCl4损伤后模型组细胞活性明显下降,仅为正常组的55.4%,各AEFFC组与模型组相比,细胞存活率均显著升高。2、AEFFC对小鼠四氯化碳急性肝损伤的保护作用(1)AEFFC降低四氯化碳肝损伤小鼠的肝脏指数:模型组肝脏指数为5.12±0.41%,明显高于正常对照组;不同浓度的AEFFC组及BDP组可降低肝脏指数。(2)AEFFC显著降低四氯化碳损伤小鼠血清AST、ALT含量:正常对照组的ALT、AST与模型组相比,均存在非常显著性差异(P<0.01),说明模型成立。各AEFFC组的ALT、AST与模型组相比,均显著或非常显著下降(P<0.05,P<0.01)。(3)AEFFC显著降低四氯化碳肝损伤小鼠血清TNF-α水平:与正常组比较,模型组小鼠血清中TNF-α水平有非常显著性差异(P<0.01);AEFFC组能显著或非常显著抑制模型小鼠血清TNF-α水平的升高(P<0.05,P<0.01)。(4)AEFFC显著提高四氯化碳肝损伤小鼠肝组织SOD活性,降低MDA含量:模型组小鼠肝组织中SOD活力明显低于正常对照组;AEFFC组和BDP组SOD活力均高于模型组。与SOD相反,模型组小鼠肝组织中MDA含量明显高于正常对照组;AEFFC组和BDP组MDA含量均低于模型组。(5)AEFFC对四氯化碳损伤小鼠肝脏病理组织学的影响:解剖显示,正常组小鼠的肝脏表面光泽度好,触感较软,颜色暗红;CCl4模型组小鼠肝脏触感偏硬,颜色土灰,体积肿大;而各AEFFC组和BDP组小鼠肝脏外观、色泽介于上述两组之间。光镜下观察HE染色结果,正常组小鼠的肝组织结构正常,肝索排列规则,肝小叶结构清楚,细胞形态正常。模型组肝小叶界限模糊,肝细胞索紊乱,肝细胞变性,细胞浊肿,空泡,点片状坏死,嗜酸性变和脂肪性变严重,炎性细胞浸润明显,有一些大片状肝细胞坏死灶。各AEFFC组肝小叶结构、细胞形态基本正常,肝细胞变性、坏死较轻,有轻微的炎细胞浸润,按照标准评估损伤积分,提示AEFFC可显著降低CCl4肝损伤程度。(6)AEFFC显著降低四氯化碳肝损伤小鼠肝细胞的凋亡:TUNEL染色显示,模型组呈现明显的凋亡形态,而AEFFC组与BDP组凋亡征象及凋亡指数明显降低。(7)AEFFC对肝损伤小鼠肝组织TNF-α mRNA表达的影响:AEFFC对TNF-αmRNA的表达影响不显著(差异量<2倍)。3、急性毒性试验小鼠的最大耐受量>24g/kg,说明AEFFC口服毒性低,安全性较大。结论:本课题以CCl4诱导的人正常肝细胞损伤体外模型及小鼠急性肝损伤体内模型为基础,从多个角度考察AEFFC对急性肝损伤的保护功能,初步探讨了AEFFC治疗急性肝损伤可能涉及的作用机制,提示AEFFC对CCl4诱导的化学性肝细胞损伤具有明显的保护作用,认为其作用机制是通过清除氧自由基、抑制脂质过氧化,从而保护肝细胞膜和线粒体膜的完整性,以及抗凋亡、减少炎性细胞因子TNF-α释放等有关。为AEFFC在肝损伤性疾病的防治提供实验依据,推动其在临床上更为广泛的应用。