论文部分内容阅读
乙酰胆碱(ACh)是第一个被发现的神经递质。大量的研究表明，ACh在学习、记忆、睡眠等脑活动中具有非常重要的作用。胆碱能神经元功能的异常与一些神经变性疾病，如老年性痴呆、萎缩性脊髓侧索坏死、Lambert-Eaton综合症等有密切的关系。乙酰胆碱转移酶(ChAT)作为ACh的合成酶被认为是胆碱能神经元的特异性标识物。因此，利用抗ChAT抗体以免疫组织化学方法来研究胆碱能神经元在神经系统中的分布及功能已得到了广泛的应用。由于ChAT在许多组织的含量非常低以及它的不稳定性，用传统的提取及纯化方法很难得到大量的ChAT。这给ChAT抗体的制备带来了许多困难。迄今所报导的多种多克隆及单克隆ChAT抗体在其效价、特异性及免疫组织化学应用中存在着多样性。利用重组DNA技术可以在合适的系统中高效表达所需的活性蛋白。ChAT cDNA及基因组DNA的阐明为利用分子生物学技术从组织中获得大景ChAT蛋白提供了可能，本文利用融合蛋白表达系统从大鼠脑中提纯ChTA蛋白并用之作为抗原制备ChAT抗体。 从大鼠脑中提取总RNA并以之作为模板用反转录PCR合成cDNA。根据大鼠脑的ChAT cDNA序列设计特异性的寡核苷酸引物。以此引物用PCR技术从反转录合成的cDNA中扩增出所需的ChAT基因片段。为了检测扩增产物的正确性，将扩增片段克隆到pGEM-T载体中，并将所得的重组质粒转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中，筛选出阳性克隆进行小量质粒DNA制备，然后进行DNA测序。对含有正确碱基序列ChAT片段的ChAT-pGEM重组质粒以及pMAL-c2表达载体用限制性内切酶Hind Ⅲ及EcoR Ⅰ进行消化。将酶切分离的ChAT DNA片段连接到pMAL-c2表达载体中。利用DNA测序对连接部位的阅读框架进行分析。将读框正确的pMAL-ChAT表达载体在大肠杆菌中培养并用异丙基硫代-B-D-半乳糖苷诱导表达麦芽糖结合蛋白(MBP)-ChAT融合蛋白。表达的融合蛋白通过amylose-resin亲合层析法进行纯化并用蛋白酶凝血因子Xa(factor Xa)进行酶切分析。用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳对酶切产物进行检测并对相应产物作N端氨基酸序列分析。用纯化的融合蛋白作为抗原按常规方法免疫Balb／c小鼠制备抗体。抗体的效价及特异性通过immunoblot及免疫组织化学染色进行检测。 利用PCR，我们得到了位于ChAT两个引物之间，长度为715bp的ChAT cDNA片段。DNA测序的结果表明，扩增的ChAT cDNA片段的核苷酸序列与所报导的完全匹配。将这段序列正确的ChAT片段插入到pMAL-c2载体中构筑表达载体。对此表达载体所作的测序分析表明ChAT cDNA片段以正确的定向被插入到pMAL载体多克隆位点的EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点之间，并位于pMAL-c2载体的malE基因(编码MBP)下游。载体与ChAT cDNA片段的阅读框架相一致，没有出现移码突变。经过在大肠杆菌诱导表达后，在SDS聚丙烯酰胺凝胶上检测到分子量为69 kDa的表达蛋白。该融合蛋白的大小与从MBP(42 kDa)及ChAT(27 kDa)氨基酸序列所推导出的分子量相一致。经过亲合层析法纯化后可从每升细菌培养物中获得20mg融合蛋白。经过factor Xa消化后，MBP-ChAT融合蛋白被消化成不同的片段。对这些酶切产物进行氨基酸测序，结果表明分子量为15kDa和12kDa的消化产品物分别为ChAT的两个片段。从而证明该表达蛋白为ChAT融合