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目的:探索获取肝癌干细胞样细胞的方法并观察其生物学特性及肿瘤干细胞表面标志物表达情况。方法:1收集采用普通培养基贴壁培养与采用无血清培养基悬浮培养的人肝癌细胞株SMMC-7721细胞。2在倒置显微镜下观察两种培养方法处理后的人肝癌细胞株SMMC-7721肿瘤细胞的形态学特征。3流式细胞仪检测两种培养方法处理后的人肝癌细胞株SMMC-7721肿瘤细胞中肿瘤干细胞表面标志CD90、CD133、CD24的各自表达量。4SYBR GreenⅠReal-Time PCR方法检测两种培养方法处理后的人肝癌细胞株SMMC-7721肿瘤细胞中肿瘤干细胞表面标志CD90、CD133、CD24对应的m RNA表达水平的变化情况。5将两种培养方法处理后的人肝癌细胞株SMMC-7721肿瘤细胞各自注射入不同的裸鼠皮下,观察并记录种植瘤的体积,依此比较两种培养方法处理后肿瘤细胞的致瘤能力及体内增殖能力。结果:1两种培养方法处理后肿瘤细胞形态学变化。倒置显微镜下观察到贴壁培养的SMMC-7721肿瘤细胞呈铺路石样生长,排列规整。而悬浮培养后SMMC-7721肿瘤细胞逐渐由单细胞聚集、增殖成球状或类球状。2应用流式细胞仪检测两种培养方法处理后肿瘤干细胞表面标志CD90、CD133、CD24的各自表达量比较。结果显示:悬浮培养组中CD90(571.77±8.70)、CD24(233.56±10.85)的表达量明显高于贴壁培养组(19.15±0.54、17.37±0.15),差异有统计学意义(CD90 t=-109.80 P=0.00;CD24 t=-34.51 P=0.00),但CD133在悬浮培养组(1.42±0.61)与贴壁培养组(1.48±1.09)中的表达量差异无统计学意义(t=0.08 P=0.94)。3两种培养方法处理后肿瘤干细胞表面标志CD90、CD133、CD24对应的m RNA表达水平的变化情况。3.1RNA的鉴定紫外线下观察可见有两条明亮的条带,分别对应于28S和18S RNA,另外有一条较暗淡的5S条带。28S和18S条带的光密度值之比约为(1.5~2):1,并且未见RNA弥散带,表明RNA完整性良好。3.2m RNA相对表达结果Real-Time PCR结果显示,CD90、CD24、CD133基因均有扩增,扩增曲线均进入平台期,熔解曲线呈标准的单峰,无杂峰出现,表明扩增产物特异。若贴壁培养组m RNA的表达量设定为1,则悬浮培养组的CD90、CD24、CD133m RNA相对表达量分别为1.72±0.19、1.72±0.19、1.05±0.03。两组相比,悬浮培养后细胞的肿瘤表面标志物CD90、CD24的m RNA相对表达量明显高于贴壁培养组,差异具有统计学意义(CD90t=-6.55 P=0.02,CD24 t=-6.71 P=0.00),而贴壁培养组的CD133m RNA表达量相比悬浮培养组的无明显差异(t=-3.41 P=0.08)。4比较两种培养方法处理后肿瘤细胞致瘤性及体内增殖能力。根据隔天测量皮下注射两种方法培养的SMMC-7721的裸鼠肿瘤长(a,单位mm)、宽(b,单位mm),按ab2/2计算出的体积(V,单位mm3)大小(贴壁培养组肿瘤细胞裸鼠皮下注射后2天:71.23±51.44,4天:60.08±24.33,6天:45.14±15.24,8天:32.56±10.16,10天:31.73±7.01,12天:26.41±13.95,14天:26.95±14.14;悬浮培养组肿瘤细胞裸鼠皮下注射后2天:60.17±47.93,4天:41.09±19.37,6天:32.90±14.13,8天:74.87±27.54,10天:97.30±37.63,12天:209.06±138.40,14天:294.69±250.65),统计学分析结果显示两组间差别有统计学意义(F=11.76,P=0.01),说明两组皮下肿瘤致瘤性及体内增殖能力有差别。而测量时间与培养方式之间存在交互作用(F=6.18,P=0.03),随着测量时间的延长,悬浮培养组所致的皮下肿瘤体积变化趋势呈从开始注射后2天到注射后6天为减小(2天:60.17±47.93,4天:41.09±19.37,6天:32.90±14.13),6天后大幅增高(8天:74.87±27.54,10天:97.30±37.63,12天:209.06±138.40,14天:294.69±250.65),贴壁培养组皮下肿瘤体积变化趋势则呈缓慢减小后趋于稳定的趋势(2天:71.23±51.44,4天:60.08±24.33,6天:45.14±15.24,8天:32.53±10.16,10天:31.73±7.01,12天:26.41±13.95,14天:26.95±14.14)。说明悬浮培养的肿瘤细胞在裸鼠体内的增值能力强于贴壁培养的。且贴壁培养组编号4的裸鼠在皮下注射肿瘤细胞14天内皮下肿瘤体积逐渐缩小至未触及,结果提示悬浮培养组比贴壁培养组致瘤性更强。结论:1悬浮培养后人肝癌细胞株SMMC-7721部分细胞获得了与肿瘤干细胞相似的部分特性,即为肝癌干细胞样细胞。2经过悬浮培养的人肝癌细胞株SMMC-7721肿瘤细胞中表达肝癌干细胞样细胞表面标志物CD90、CD24的量明显比贴壁培养的肿瘤细胞多,且所对应的m RNA相对表达量也是相应增高的。但CD133及其对应的m RNA表达效果在两种培养方法的肿瘤细胞中无明显差别。因此,悬浮培养后的人肝癌细胞株SMMC-7721肿瘤细胞中可能存在肝癌干细胞,但肝癌干细胞样细胞的特异性细胞表面标志物仍需进一步筛选及确定。3两种不同培养方法处理的人肝癌细胞株SMMC-7721肿瘤细胞对裸鼠的致瘤性及体内增殖能力有明显差异。悬浮培养法与贴壁培养法相比,处理后的肿瘤细胞致瘤性及体内增殖能力更强,再次说明悬浮培养后的人肝癌细胞株SMMC-7721肿瘤细胞中可能存在肝癌干细胞。但悬浮培养法是否可作为获取肝癌干细胞样细胞首选的研究方法仍需进一步讨论。