两株海洋细菌Stenotrophomonas sp.NTa和Vibrio sp.JMUAZ5琼胶酶的研究

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本论文选取从厦门红树林泥土样品中分离得到的两株产琼胶酶的海洋细菌NTa和JMUAZ5作为研究对象,利用层析法对菌株NTa琼胶酶进行了分离纯化,进一步研究纯酶酶学性质及其酶解产物。从分子水平对菌株JMUAZ5进行了初步鉴定,研究了该菌株粗酶酶学性质及其酶解产物,得到如下结论:(1)从厦门红树林泥土和沙土样品中筛选分离出7株产琼胶酶的菌株,对其16S rRNA基因序列进行分析,得到的结果为其中6株被初步鉴定为弧菌属(Vibrio sp.),1株被鉴定为寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)。通过构建系统进化树,菌株JMUAZ5与Vibrio diabolicus P4-1(GenBank登录号:KC261281)的系统发育关系最为密切,该菌株命名为Vibrio sp.JMUAZ5。(2)将Stenotrophomonas sp.NTa琼胶酶进行分离纯化,获得了电泳纯琼胶酶。酶比活力大小为8.2 U/mg,纯化倍数为9.1,回收率为2.0%。通过SDS-PAGE及分子筛确定其相对分子量分别为89.1 kDa和179.7 kDa,表明该酶为同聚二聚体蛋白。(3)Stenotrophomonas sp.NTa琼胶酶纯酶最适反应温度和pH值分别为40°C和8.0,且当温度低于40°C,pH值在5.0-11.0的范围内时稳定。Na+、K+、Ca2+、Mg2+和Ba2+均不同程度的刺激了酶的活性,Zn2+、Mn2+、Cu2+、Cd2+、Co2+、Fe2+、Al3+和Fe3+对该琼胶酶有不同程度的抑制作用;Ag+对酶活性没有影响。该琼胶酶对考察的抑制剂、去垢剂及变性剂有良好的抗性。该酶的动力学参数Km、Vmax、kcat和kcat/Km分别为11.3 mg/mL、25.4U/mg、760.1 s-1和67.0 s-1 mg-1 mL。利用薄层色谱法和MALDI-TOF-MS质谱法分析酶解产物,结果表明,Stenotrophomonas sp.NTa琼胶酶纯酶酶解主产物为二糖、四糖和六糖。此外,酶解产物具有还原力,清除OH自由基、清除DPPH自由基及清除ABTS自由基的抗氧化活性。(4)Vibrio sp.JMUAZ5琼胶酶粗酶的底物专一性研究表明该琼胶酶粗酶对琼胶有良好专一性。粗酶的最适反应温度和pH值分别为40°C和8.0,粗酶在温度为20°C和25°C,pH值在6.0-10.0范围内时稳定。Li+、Co2+、Ca2+和Al3+对该酶活性有激活作用,Ag+、Zn2+、Mg2+、Ba2+、Mn2+、Cu2+、Fe2+和Fe3+均不同程度地抑制酶了的活性,Na+、K+和Ni2+对酶活性没有影响。该琼胶酶粗酶对考察的抑制剂、去垢剂和变性剂有好的抗性。另外,Vibrio sp.JMUAZ5琼胶酶粗酶的酶解产物具有还原力和清除ABTS自由基的抗氧化活性。
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