背景食管癌占世界恶性肿瘤发病的第八位,死亡率第六位,90%的食管癌病理类型为鳞癌或者腺癌。食管鳞癌发生是由于食管鳞状上皮增殖导致其从低级别不典型增生到重度不典型增生,再发展为浸润性的鳞癌。我国食管癌分布较为广泛,但也表现出明显的地区差异,中国北方的食管癌发病率总体较高。饮酒、食用腌制食品等含亚硝酸盐高的食物、营养缺乏、感染因素和嗜食烫饮等是我国食管癌发病的主要原因,同时遗传因素在食管癌的发病中也起着重要作用。恶性肿瘤发生的分子基础包括遗传和表观遗传两方面。在遗传学机制中发生了基因突变、微卫星不稳定和杂合丢失等现象,其特点是DNA序列发生了改变,引起基因表达水平也发生了改变。而表观遗传学则不同,指的是非基因序列改变的原因所导致的基因表达的改变。在恶性肿瘤的发生中遗传和表观遗传异常是相互关联的,无论是遗传原因或是表观遗传原因单独或是协同作用都可能导致细胞的恶变。表观遗传学是一个具有广阔前景的生物医学研究领域。抑癌基因、DNA修复基因及侵袭转移基因的启动子甲基化等多种表观遗传机制在调控基因表达方面发挥了作用,其中研究热点是DNA甲基化。在人类癌症中DNA甲基化包括全基因组甲基化和特定位点CpG岛启动子甲基化,基因重复序列或长散在重复序列甲基化会导致基因重组或染色体缺陷,影响基因转录的稳定性。那么在食管鳞癌中抑癌基因甲基化发生率如何,其后果是否对肿瘤的发生产生影响,我们在本研究中选择了两个不同的抑癌基因,利用食管细胞系和临床标本研究食管鳞癌中抑癌基因的角色和作用。放射治疗是临床食管鳞癌治疗的一种重要的手段,通常与手术及化疗等联合用于食管癌的治疗。放射线直接对细胞的DNA发生作用,其影响包括(1).直接作用：射线损伤DNA分子链,造成DNA的单链或双链断裂；(2).间接作用：射线对水分子作用,产生电离效应,继而产生H+、OH-自由基,自由基与生物大分子作用后引起DNA分子链结构及功能的损害。相对于手术而言,射线治疗优点包括：(1).适应症广,从原位癌到Ⅳ期癌肿的各期肿瘤均可行放射治疗；(2).总体有效率较高,特别对于早期患者以及颈段食管患者,5年生存率甚至达到与手术相仿的水平； (3).对病例的适应证手术适应证宽松,更多患者可以从中获益；(4).从技术角度而言放射治疗较手术治疗相对容易操作。放射治疗或者辅助放射治疗的选择主要根据一些临床病理参数,如TNM分期,性别,年龄,分化程度等,但对于预测肿瘤的生物学行为、放射敏感性以及放射抵抗没有合适的分子生物学标记物。由于放射抵抗是导致放疗失败(无效)或癌肿复发的重要原因,目前对于食管鳞癌放射抵抗原因的研究尚且很少,DNA甲基化在放射抵抗中的作用于机制尚不明确。因此,在本研究就此进行了实验研究及深入探讨。本研究目的如下：(1).通过研究食管鳞癌KYSE150, KYSE180细胞系辐照前后CHFR及CDKN2A基因DNA甲基化程度变化及mRNA的表达变化,研究抑癌基因的甲基化及其基因表达能力的改变是否参与到食管鳞癌的放射抵抗。(2).通过研究28例食管鳞癌组织、癌旁组织及正常食管组织CHFR及CDKN2A基因DNA甲基化与临床病理关系,研究CHFR及CDKN2A基因DNA甲基化在食管鳞癌发生、发展过程中的作用及意义。方法研究一、放射抵抗细胞系中CHFR及CDKN2A基因DNA甲基化表达情况1.细胞复苏、传代及辐照选择KYSE150, KYSE180细胞系,在适量RPMI1640细胞液中轻轻吹打至散开后移入培养瓶内,置于37℃,5%二氧化碳的细胞培养箱进行细胞培养、扩增,随后进行传代。将在对数生长期生长的KYSE150, KYSE180细胞制作为细胞悬液,800rpm, 10min中离心,弃去上清,使用1640培养基重悬细胞,调整细胞浓度,将细胞分别接种在六孔板中,每孔1*105个细胞,待细胞贴壁、密度在70%左右且状态良好时,分别给予8Gy的高能量X射线(放射源距离标本100cm,照射野大小为20cm×20cm,吸收剂量率为1.50Gy/min.)照射后,37℃、5%二氧化碳培养,并及时更换培养液；细胞照射后第5天,以上述剂量再次处理细胞,并及时更换培养液,直至细胞凋亡、坏死后形成细胞克隆。将辐照耐受的细胞系称为KYSE150-8Gy, KYSE180-8Gy细胞系。2.DNA的提取、甲基化处理及焦磷酸测序收集处于对数生长期的细胞(KYSE150, KYSE180, KYSE150-8Gy, KYSE180-8Gy),2*106/管,加入DNA提取液200 μ 1,并加入10mg/ml的蛋白酶K至终浓度100μg/ml,使细胞完全裂解,之后56度,水浴2小时,向消化后的DNA样品中加入250u1酚氯仿,盖上管盖,颠倒混匀。经样本离心,再次氯仿抽提,吸取上清后无水乙醇处理等步骤,最后向沉淀中加入100μlTE溶液,室温溶解15分钟,期间轻轻振荡混匀,完成细胞系样本中DNA的提取,提取后的DNA用重亚硫酸盐处理完成甲基化。采用PyroMark Assay design 2.0针对CDKN2A和CHFR基因启动子CpG岛设计PCR引物和测序引物,按PyroMark PCR Kit试剂盒(德国,Qiagen)说明书要求完成焦磷酸测序前的PCR扩增反应。3.样本总mRNA提取及RT-PCR收集处于对数生长期的细胞(KYSE150, KYSE180, KYSE150-8Gy, KYSE180-8Gy),2*106/管,每管加入1. Oml Trizol溶液,裂解细胞后加入氯仿处理,经离心吸取上清加入异丙醇,冰上放置十分钟后离心,吸去管中液体,75%乙醇处理后溶解RNA,完成RNA提取。取0.5ml EP管,将RNA与引物的混合物,将5 X buffer, DTT,逆转录酶M-MLV等反应品顺序加入进行RT反应,得到cDNA,之后进行实时荧光定量PCR扩增,数据统计、结果分析等。4.放射抵抗细胞系与原始细胞系细胞增殖实验KYSE150、KYSE150-8G、KYSE180及KYSE180-8G细胞起始接种浓度为1*105／瓶,分别于1,3,5,7天消化后计数,配对比较细胞系增殖能力。研究二、食管鳞癌、癌旁及正常食管组织中CHFR, CDKN2A基因异常甲基化研究1.标本来源28例标本来选自2014.5.～2015.4.期间安徽省立医院胸外科手术切除的原发性食管鳞癌病例,其中男性25例,女性3例；病理分期Ⅰ期病例8例,Ⅱ期病例15例,Ⅲ期病例5例。实验使用的组织样本为肿瘤组织,肿瘤旁组织及距离肿瘤至少5cm以远的食管正常组织。本组病例手术前未行放疗、化疗,病理资料完整,术后长期随访,资料完备,上述病例来源的患者均已知情同意。2.DNA的提取、甲基化处理及焦磷酸测序在液氮中研磨组织标本(100mg),加入DNA提取液200 μ1,继续研磨至匀浆,并加入10mg/ml的蛋白酶K至终浓度100μ g/ml,之后56度,水浴2小时,向消化后的DNA样品中加入250ul酚氯仿,盖上管盖,颠倒混匀。经样本离心,再次氯仿抽提,吸取上清后无水乙醇处理等步骤,最后向沉淀中加入100μl TE溶液,室温溶解15分钟,期间轻轻振荡混匀,完成细胞系样本中DNA的提取,提取后的DNA用重亚硫酸盐处理完成甲基化。采用PyroMark Assay design 2.0针对CDKN2A和CHFR基因启动子CpG岛设计PCR引物和测序引物,按PyroMark PCRKit试剂盒(德国,Qiagen)说明书要求完成焦磷酸测序前的PCR扩增反应。3.样本mRNA提取及RT-PCR在液氮中研磨组织标本(100mg),加入1. 0ml Trizol溶液,磨成匀浆,加入1. 0ml Trizol溶液,加入氯仿处理,经离心吸取上清加入异丙醇,冰上放置十分钟后离心,吸去管中液体,75%乙醇处理后溶解RNA,完成RNA提取。取0.5m1EP管将RNA与引物的混合物,将5 X buffer, DTT,逆转录酶(M-MLV)等反应品顺序加入进行RT反应,最后进行反应及分析结果。结果研究一、1.KYSE150, KYSE180及KYSE150-8Gy, KYSE180-8Gy细胞系的DNA甲基化特异性检测均发现CHFR及CDKN2A基因DNA甲基化现象；2.放射抵抗的KYSE150-8Gy,KYSE180-8Gy细胞系中CHFR及CDKN2A基因DNA甲基化程度高于KYSE150, KYSE180细胞系；3.而KYSE150-8Gy, KYSE180-8Gy细胞系CHFR及CDKN2A基因mRNA表达显著低于KYSE150, KYSE180细胞系。4.KYSE150-8Gy, KYSE180-8Gy细胞系增殖能力显著高于KYSE150, KYSE180细胞系,p<0.05。研究二、1.28例患者完成了本研究,样本为癌组织、癌旁组织及正常食管组织成对样本。CHFR基因DNA甲基化发生率分别为46.32%、42.05%和22.33%; CDKN2A基因DNA甲基化发生率分别为27.51%、24.54%和10.89%。正常食管组织内CHFR及CDKN2A基因甲基化发生率显著低于癌组织及癌旁组织,但CHFR及CDKN2A基因甲基化与肿瘤分期无关。2. CHFR及CDKN2A基因mRNA在不同组织中的差异：CHFR和CDKN2A基因mRNA表达在癌组织及癌旁组织中显著低于正常组织(p< 0.001), CDKN2A基因mRNA表达在癌组织中也低于癌旁组织,差别具有统计学意义(p=0.026)3. CHFR及CDKN2A基因mRNA在癌组织、癌旁组织及正常食管组织表达差异与临床分期无关。4. mRNA在癌组织、癌旁及正常食管组织表达差异与肿瘤分化程度关系：CHFR基因mRNA在癌组织中表达差异与分化程度无关,在癌旁组织中中分化癌与低分化癌表达程度具有统计学意义(p=0.034)：在正常组织中表达差异与分化程度无关。CDKN2A基因mRNA在癌组织中表达差异与分化程度无关,在癌旁组织中表达差异与分化程度无关；在正常组织中表达中分化癌与低分化癌表达差异具有统计学意义(p=0.023)。结论研究一1.食管鳞癌CHFR及CDKN2A基因甲基化在KYSE-150、KYSE-180食管鳞癌细胞系是一种高发现象。2.大剂量辐照后,形成放射线耐受细胞系,KYSE-150-8Gy、KYSE-180-8Gy细胞中CHFR、CDKN2A基因甲基化程度高于原始细胞系,与此相对应的CHFR、 CDKN2A基因mRNA表达显著低于原始细胞系,说明CHFR、CDKN2A基因高甲基化导致的肿瘤抑制功能的丧失,使癌肿细胞DNA修复能力和抗凋亡能力显著加强,并因此抗拒了放射线的灭活。3.放射抵抗细胞系KYSE150-8Gy, KYSE180-8Gy肿瘤增殖能力增强,具有更为恶性的生物学行为。研究二1.食管鳞癌癌组织、癌旁组织及正常组织中存在CHFR及CDKN2A基因甲基化现象,说明该基因甲基化是食管鳞癌发生发展中的一种表观遗传事件。2.正常组织甲基化比率显著低于癌组织及癌旁组织,且与mRNA表达一致,说明CHFR及CDKN2A基因甲基化导致的失活可能也参与到食管鳞癌的发生阶段。3. ESCC癌组织及癌旁组织中CHFR及CDKN2A甲基化比率显著高于正常组织,mRNA表达显著低于正常组织,但DNA甲基化程度与肿瘤分期无关,说明在肿瘤的进程中作为抑癌基因的CHFR及CDKN2A基因甲基化并由此导致的表达缺失贯穿于食管鳞癌的整个发展过程。4. CHFR及CDKN2A基因甲基化与肿瘤的分期无关,与肿瘤的分化程度部分相关(CHFR的mRNA在中分化与低分化患者癌旁组织的表达有差异,CDKN2A的mRNA在中分化与低分化患者正常组织中表达有差异),说明CHFR及CDKN2A基因甲基化可能是食管鳞癌发生的早期分子事件,并与肿瘤的恶性程度有关。