背景:膀胱粘膜上皮除了发挥传统的屏障功能外,近年来研究发现还表达多种感受性离子通道和受体,例如TRP通道、Pannexin 1通道、Piezo 1通道、及胆碱能受体、嘌呤能受体等,能够感受机械、化学、温度刺激,并释放ATP、乙酰胆碱(Ach)、NO等介质及多种神经生长因子和细胞因子。因而,膀胱粘膜被认为是一个感觉器官。生理情况下,膀胱粘膜上皮能够感受膀胱充盈的机械刺激,上皮感受机械刺激的机制近年来受到很大的关注。有研究表明,膀胱充盈过程中粘膜上皮受到机械牵张刺激,导致胞内Ca2+的升高及ATP的释放,进而激活感觉末梢上的P2X3受体,导致感觉神经的兴奋是膀胱感觉产生的重要机制。但目前膀胱粘膜上皮感受机械刺激诱发胞内Ca2+升高的细胞及分子机制尚不清楚。在粘膜上皮表达的机械感受TRP通道中,以TRPV4表达最丰富。有研究认为TRPV4在牵张刺激激活后,可引发一系列生理反应,在膀胱充盈感的产生及排尿反射的启动中起重要作用。近年来随着相关研究的进展,TRPV4在膀胱感觉功能中的作用被日益揭示,但TRPV4感受膀胱充盈刺激后,细胞内Ca2+升高及是否存在其他因子如ATP的释放的具体细胞机制,还不清楚。本部分研究以培养的大鼠膀胱粘膜上皮为研究对象,通过制造液气界面给予粘膜上皮细胞一个快速的机械刺激,记录该机械刺激激发的胞内Ca2+的升高,试图阐明TRPV4通道在膀胱粘膜上皮感受机械刺激的作用及胞内Ca2+升高具体的细胞内机制。方法:选取2-3个月健康成年SD大鼠的膀胱,体外分离及培养膀胱粘膜上皮。培养2天后,通过制造液气界面引起细胞表面张力的改变使细胞变型,从而给予细胞一个快速的机械刺激。以钙离子成像技术记录胞内Ca2+升高,并通过应用膜通道或胞内信号分子的阻断剂观察参与的膜通道类型及胞内分子机制。结果:(1)机械刺激可诱发胞内Ca2+升高,且同一细胞可重复;(2)机械刺激引起的胞内Ca2+升高可诱发ATP释放;(3)免疫组化检测显示膀胱粘膜上皮大量表达TRPV4通道;(4)胞内Ca2+升高可被非特异性的机械通道阻断剂GdCl3(100μ M)阻断(74.8%)(5)胞内Ca2+升高可被TRP通道非特异性阻滞剂Ruthenium Red(10 μM)明显阻断(35.7%);(6)胞内Ca2+升高可被TRPV4通道特异性阻滞剂HC067047(10 μM)明显阻断(41.1%);(7)胞内Ca2+升高可被内质网钙库上IP3受体阻断剂2-APB(10 μ M)明显阻断(71%)。结论:TRPV4为膀胱粘膜上皮感受机械刺激的重要膜通道,其激活后会引起胞内Ca2+升高并释放ATP;TRPV4可联合内质网IP3受体,诱发胞内钙库释放Ca2+,共同参与上皮机械传导的功能。背景:膀胱粘膜由粘膜上皮层及粘膜下层(固有层)组成,近年来被认为既是膀胱的保护层又在尿控中起感受器官的作用。以往对膀胱粘膜感觉功能的研究主要集中在膀胱粘膜上皮及固有层的感觉神经末梢上。对于数量最多的间质细胞(interstitial cell,1C)的研究也多局限于动物模型,对于1C表达的感受器分子的研究也仅局限于mRNA及蛋白表达水平。研究表明,粘膜下1C细胞与感觉神经末梢有密切接触,可能能够调控膀胱的感觉传导,但具体调控机制还不明确。例如1C的感觉调控作用是否与其表达的TRP通道有关还鲜有研究。目的:本研究通过钙成像、免疫荧光等技术,探索1C细胞(特别是浅固有层1C细胞)各种感觉相关通道(特别是TRP通道)的蛋白及功能表达,试图揭示这些通道在膀胱感觉传入功能中的作用。方法:(1)获取膀胱部分切除的病人的膀胱组织,免疫荧光技术显示人膀胱组织1C细胞多种TRP通道表达情况;(2)从病人的膀胱组织,原代培养分离人膀胱1C,并通过细胞免疫荧光技术进一步鉴别是否具有1C细胞的典型特征;(3)Ca2+成像技术观察记录人膀胱1C细胞多种TRP通道的功能表达。结果:(1)人膀胱组织免疫荧光显示:固有层及肌束间有大量VimentindC细胞特异性标记物)阳性的1C细胞,并且浅固有层的1C细胞均有a-SMA表达;(2)细胞免疫荧光显示:原代培养的人膀胱间质细胞均表达Vimentin、d-SMA,并表达TRPA1和TRPV4,表明原代细胞提取获得的细胞以浅固有层的1C细胞为主,(3)钙成像实验发现:培养获得的1C细胞可以被TRPA1的激动剂AITC激活,引发胞内钙离子升高,并释放ATP,且激活效应可被TRPA1特异性拮抗剂HC030031部分阻断;同时细胞还可以被TRPV4的激动剂GSK1016790A激活,引发胞内钙离子升高并释放ATP,其激活效应可以被TRPV4特异性拮抗剂HC067047阻断。结论:浅固有层1C细胞具有感受化学刺激(TRPA1)及机械刺激(TRPV4)的功能,并可释放信号传导分子ATP,1C细胞可能通过与附近粘膜上皮及感觉神经末梢的双向信息交流在膀胱感觉传入中起一定作用。背景:良性前列腺增生(BPH)在老年男性中非常常见,流行病学显示,我国50岁以上男性患病率高达50%。病变的增大的前列腺可能压迫尿道,导致膀胱出口梗阻(B00),进而导致包括储尿期和排尿期症状在内的下尿路症状(LUTS)。膀胱的牵张会引起膀胱粘膜上皮细胞的激活并释放ATP至尿液中。既往有研究表明,BPH患者的尿中ATP浓度明显高于无症状对照组。而且有研宂表明,作为目前主要诊断依据的国际前列腺症状评分(IPSS)对诊断B00患者和预测其严重程度的作用可能没有想象的那么大。尿动力学检查(UDS)是评估B00梗阻程度的金标准。但是,USD是一项侵入性检查,同时具有耗时的特点,且对某些患者而言相对较为昂贵。另外部分医院从软硬件条件上可能并不能满足UDS的幵展。上述这些原因都意味着我们需要非侵入性且成本较低的方法或生物标记物,来评估BPH患者B00的存在和梗阻程度。传统观念上,膀胱粘膜上皮被认为是一层屏障,保护膀胱不被尿液内有害物质的损伤,但近年报道具有感觉神经元的特性,例如可以通过释放包括ATP,ACh和PGE2在内的神经递质或介质对机械和化学刺激作出反应。释放的ATP激活粘膜上皮下的感觉传入神经的P2X3受体,从而触发排尿反射。研究发现,在膀胱过度活动症、间质性膀胱炎以及膀胱感染或炎症等病理条件下,患者尿路上皮释放ATP增多,尿液中的ATP浓度也相应增加。因此,有观点提出ATP可以作为此类病理情况的一个相关的生物标记物。对于处于代偿期的BPH患者,排尿期膀胱内压力会随着B00程度的增加而增力口,并且可能会释放更多的ATP。因此,可以通过测量尿中ATP浓度来推断B00的程度。因而,在本研究中,我们旨在探讨尿中ATP水平作为一项无创的指标辅助判断膀胱出口梗阻(B00)的存在及其严重程度的可能性。方法:我们纳入了117名接受尿动力学检查的BPH患者和109名无症状对照。收集患者和对照组的正常尿意时的尿液样本,并在BPH患者行压力-流率测定时收集最大膀胱容量时的膀胱内灌注液体和排尿排出的液体。荧光素酶生物发光测定法测量收集样品中的ATP浓度,并通过尿肌酐(ATP/Cr)进行标准化。BOO的程度用BOO指数(B00I)定量。通过分析BPH患者尿动力学参数特别是B00I与尿液ATP浓度之间的相关性,确定尿液ATP浓度作为诊断B00及其程度的可能性。结果:BPH患者尿液ATP浓度显着高于对照组(ATP:118.54±7.18 vs 47.67±2.42nM;ATP/Cr:126.20土7.99 vs 51.8±2.63pmol/mg,p<0.001)。对于BPH患者,尿液ATP浓度与B00I之间存在显着正相关(r=0.5441,p<0.0001)。尽管有逼尿肌过度活动(DO)或有急性尿潴留(AUR)病史的BPH患者的尿液ATP水平会明显升高,但在这些患者中仍旧能够观察到ATP与B00I之间显着正相关关系。当将BOOIMO设置为区分B00和非B00患者的临界点构建R0C曲线时,曲线下的面积(AUC)为0.77(p<0.001)。结论:BPH患者尿液ATP水平增加。尿液ATP可用作B00的非侵入性生物标志物,其水平可能对梗阻程度具有预测价值。