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新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)强毒引起的严重危害全球养殖业的主要疫病之一。鸽源新城疫病毒,也称为鸽Ⅰ型副黏病毒(pigeon paramyxovirus type 1,PPMV-1),是鸡源NDV在鸽体内适应后形成的变异株,遍布世界各地,给养鸽业带来了巨大的经济损失。PPMV-1自上个世纪80年代传入我国之后,便在我国多个省份和地区长期存在并流行,严重阻碍了我国养鸽业的健康发展。为了解鸽群中PPMV-1的流行情况,本研究对2016~2020年从我国部分地区分离到的19株PPMV-1进行了分子流行病学调查,并测定了其生物学特性。接着进一步对我国PPMV-1进行了进化动力学分析,旨在阐明我国PPMV-1的进化和传播动态,同时也为制定科学的PPMV-1防控措施提供理论依据。已有研究表明,鸽源NDV具有明显的宿主偏嗜性,但是相关的分子机制并不明确,为此,本研究系统地比较了PPMV-1和鸡源NDV的生物学特性、致病性以及传播特性差异,然后利用反向遗传学技术进一步探究了 PPMV-1宿主偏嗜性的分子机制。1.2016~2020我国部分地区鸽源新城疫病毒的分子流行病学2016~2020年从我国部分地区的发病鸽的病料中共分离到19株PPMV-1。F基因遗传进化分析表明所有分离株均属于VI.2.1.1.2.2亚型。19株PPMV-1的F及HN核苷酸序列的同源性分别是96~99.9%和96.4~99.9%,氨基酸序列的同源性分别为96.4~99.8%和 96.5~99.8%,与欧洲毒株 PPMV-1/Belgium/11-09620/201 1 处于同一分支。19株分离株与目前我国广泛使用的疫苗株La Sota遗传距离较远,所有分离株与La Sota的F及HN基因核甘酸同源性分别为83.4~84.2%和81.8~82.6%,氨基酸序列的同源性分别为87.5~88.8%和86.7~87.4%。与VI.2.1.1.2.1亚型PPMV-1的F和HN蛋白进行对比,所有分离株均出现了特异性的氨基酸变化。19株PPMV-1分离株的F蛋白裂解位点基序均为112RRQKRF117,呈典型的强毒特征,但是ICPI测定结果显示,所有的分离株均属于中等毒力株,表明除了 F蛋白裂解位点之外,还有其他基因或者结构域影响了病毒毒力。值得注意的是,本研究发现虽然有些PPMV-1分离株在鸽源细胞和鸽中的复制水平相似,但是在鸡源细胞和鸡中的复制能力却有显著性差异,这提示在鸡源细胞上和鸡中能够高效复制的PPMV-1具有在鸡群中引起大流行的潜在风险。综上所述,本章揭示了当前我国部分地区PPMV-1的流行情况,也为进一步研究我国PPMV-1的进化动力学奠定了基础。2.我国鸽源新城疫病毒的进化动力学为了阐明我国PPMV-1的进化动力学,本研究首先基于427株NDV的F基因编码区绘制最大似然进化树,结果显示来自中国地区的186株PPMV-1均属于基因Ⅵ型,其中大多数毒株属于Ⅵ.2.1.1.2.2亚型。接着对186株PPMV-1的宿主来源进行统计,结果显示186株PPMV-1中有178株来源于鸽,这也进一步说明了 PPMV-1对鸽具有明显的宿主偏嗜性。历史种群大小重建表明我国PPMV-1的种群大小变化共经历了 6个不同的时期。采用贝叶斯方法对我国PPMV-1进行时空动力学分析,结果表明华东和华南地区是我国PPMV-1主要的扩散中心,介导了 PPMV-1八条迁移路线,在我国PPMV-1的传播过程中发挥着至关重要的作用。适应性进化分析表明,我国PPMV-1的6个基因均存在正向选择位点,其中大部分正向选择位点位于NP、P和L基因上面。氨基酸序列分析表明,与鸡源NDV相比,PPMV-1的6个蛋白中均有特异性氨基酸的替代,其中有23个位点位于NP、P和L蛋白上,其余9个位点位于M、F和HN蛋白上。适应性进化分析和氨基酸序列分析结果提示NP、P和L三个基因可能与PPMV-1的宿主偏嗜性有一定的关系。综上所述,本章系统地分析了我国PPMV-1的进化动力学,为了解我国PPMV-1的进化及制定合理的PPMV-1防控措施提供了理论参考,也为进一步深入研究PPMV-1的宿主偏嗜性提供了线索。3.鸽源和鸡源新城疫病毒的致病性和传播特性比较为了找到探究PPMV-1宿主偏嗜性分子机制的关键切入点,本研究系统地比较了PPMV-1(NT-10和JS/09/16/Pi)与鸡源NDV(Kuwait256)的生物学特性、致病性和传播特性差异。毒力指标MDT和ICPI测定结果表明Kuwait256为强毒株,NT-10和JS/09/16/Pi为中等毒力株。膜融合能力、病毒受体结合特性和神经氨酸酶活性分析结果表明Kuwait256的膜融合能力、受体结合能力和神经氨酸酶活性均明显高于NT-10和JS/09/16/Pi。此外,生长曲线测定结果表明Kuwait256在鸡源细胞中的复制能力显著强于NT-10和JS/09/16/Pi,相反Kuwait 256在鸽源细胞中的复制能力却不及NT-10和JS/09/16/Pi,但这3株病毒在哺乳动物细胞中的复制水平并没有显著差异。致病性试验结果表明Kuwait256能导致SPF鸡全部发病死亡,然而NT-10和JS/09/16/Pi并不能使SPF鸡产生明显的临床症状且在鸡体内的复制水平较低。值得注意的是,Kuwait 256,NT-10和JS/09/16/Pi均能导致鸽发病并死亡。鸽子传播试验结果表明NT-10和JS/09/16/Pi均能在鸽中有效传播,然而Kuwait 256却不能在鸽中进行传播。上述结果表明与鸡源NDV相比,鸽源NDV毒株在鸡体内复制能力弱,但在鸽中具有很强的传染能力,这为进一步研究PPMV-1宿主偏嗜性的分子机制提供了重要参考。4.鸽源新城疫病毒宿主偏嗜性的分子机制基于本研究已有结果,继续探讨PPMV-1宿主偏嗜性的分子机制。本研究首先构建了 Kuwait256株和NT-10株的感染性克隆,接着以NT-10株为骨架,利用反向遗传学技术,将Kuwait 256株的内部蛋白NP、P、L或者外部蛋白M、F、HN联合替换至NT-10上,成功构建并拯救了 2株重组病毒(rNT-KMFHN和rNT-KNPPL)。进一步评价了 2株重组病毒及其母本病毒的生物学特性、致病性以及传播特性差异。结果表明,NT-10骨架中同时表达Kuwait 256的NP、P和L基因时,重组病毒rNT-KNPPL的毒力和在鸡源细胞中的复制能力明显增强,与rKuwait256相似。此外,rNT-KNPPL对鸡的致病性以及在鸡中的复制能力也明显强于rNT-KMFHN和rNT-10。然而,与rNT-KMFHN和rNT-10相比,重组病毒rNT-KNPPL丧失了在鸽中的传播能力。综上所述,本研究结果表明NP、P和L基因是决定PPMV-1宿主偏嗜性的关键基因。