研究背景：在日常生活中,人们常常由于龋病、牙周病、外伤等造成牙列缺损、缺失,失牙后不同程度地影响美观、咀嚼、发音等功能,长期牙缺失会对肌肉关节造成影响,严重时使口颌系统失调。而种植体发展至今,以其固位力强、咀嚼效率高、美观舒适等优点,已成为口腔医学中首选的修复方法。根据瑞典哥德堡大学的Perlngvar Branemark和瑞士伯尔尼大学的Andre Schroeder各自的研究组完成的基础实验研究,牙种植体替代部分或全部缺失牙已经成为科学所接受的治疗方案。在20世纪60年代末和70年代所发表的里程碑性的论文中,两个研究组均描述了钛种植体的骨整合现象,其特点为活性骨直接沉积在钛表面。种植体的表面处理已获得大量被认可的研究结果,那为什么我们还要继续优化其表面处理方式呢?因为现代牙种植学的研究目标是使种植体具备良好的初期稳定性,并在早期即实现初期骨整合,以在最早时间内获得最佳、最稳定的种植体—骨整合界面,最大限度地保存周围骨质,以提高种植义齿的远期成功率。微弧氧化法(Microarc Oxidation, MAO)属于电化学方法的一种,在用于种植体表面改性方法以来,在膜层结合强度、晶相磷灰石含量等方面都体现出优势。上世纪90年代末期利用微弧氧化技术对纯钛进行表面处理成为热点。研究表明经微弧氧化处理的钛种植体材料表面对成骨细胞的生长无毒性作用,有利于成骨细胞在其表面的生长、增殖与分化,具有优于纯钛种植材料的细胞生物相容性,使新生骨质与微弧氧化膜成为机械嵌合结构,稳定了成骨界面。但是,根据目前文献报道,种植体形成早期骨整合后骨整合面积不足,仅(45±16)%,最多50%-75%,经过微弧氧化处理后早期种植体的骨-种植体接触率(Bone-Implant Contact, BIC)也仅有(49±12)%,远远低于100%。因此,如何提高微弧氧化处理的种植体表面活性成为研究热点。1972年,A.Fujishima和K. Honda在n型半导体TiO2电极上发现了水的光电催化(Photocatajytic Reaction)分解作用,并以此为契机,开创了多相光催化研究的新纪元。1997年,A. Fujishima在Nature上报道了TiO2具有光诱导超亲水性现象。由于TiO2氧化膜是钛种植体获得骨整合的重要膜层,而紫外线照射后恰能诱导TiO2氧化膜表面产生高亲水性能,同时降低氧化膜表面碳水化合物等有机污染。因此,近年来人们越来越多的探索经过紫外线照射改性TiO2氧化膜的方法,并应用于口腔种植材料。目前研究表明,TiO2表面的光致超亲水性起源于其表面结构的变化：TiO2锐钛矿对应的禁带宽度(价带与导带之间的能量差Eg)为3.2ev,它在波长短于380nm的紫外线照射下,TiO2价带(充满电子的最高能带Valence Band, VB)电子被激发到导带(未充满电子的最低能带Conduction Band, CB),电子和空穴向表面迁移,电子与Ti4+反应,空穴则与表面的氧离子反应,分别形成Ti3+和氧空位。这时,空气中的水解离吸附在氧空位中,成为化学吸附水(即羟基,OH-属于亲水性基团,易于物理吸附水形成氢键,使材料表面亲水性增强),化学吸附水可进一步吸附空气中的水分,形成物理吸附层。于是在Ti3+缺陷周围形成了高度亲水的微区,而表面剩余区域仍保持疏水性,这样就在TiO2表面构成了具有均匀分布的纳米尺寸区分的亲水区、疏水区,类似于二维的毛细管现象。由于水液滴的尺寸远大于亲水区面积,宏观上表现为水在其表面的接触角变小。目前已有报道,使用UVC波段紫外线照射酸蚀纯钛后,产生了超亲水性表面,促进成骨细胞在材料表面的黏附、增殖与分化。动物实验中第四周BIC即由51.7%提高至98.2%。本课题组前期实验中,使用UVC和UVA波段紫外线分别处理微弧氧化纯钛表面,相对于UVA波段紫外线-微弧氧化组及不光照-微弧氧化组比较而言,UVC波段紫外线-微弧氧化组能明显增加蛋白吸附,利于MG-63细胞在其表面的黏附、伸展、增殖并能增强ALP活性。然而,目前尚无使用UVC波段紫外线处理微弧氧化种植体表面并植入动物体内,观察其早期成骨状态的研究报道。因此,本实验旨在通过上述方法,在成骨早期、中期阶段观察种植体与兔胫骨的骨整合情况,以便在成骨早期即可获得初期骨整合的方法,为长久地保持种植体成功率提供可能性。目的：观察成骨早期的成骨方式及成骨各阶段的骨整合状态,以达到紫外线照射微弧氧化种植体后,早期即能促使种植体表面紧密吸附大量成骨细胞而生长成新生骨质,促进骨组织与种植体的接触成骨。方法：1.种植体制备及表面处理分组种植体分为两组：对照组为微弧氧化组(MAO),实验组为UVC波段紫外线照射微弧氧化组(UVC+MAO)。用商业二级纯钛钛棒加工出一定规格的特殊的种植体,此植体有两个骨环,可以突出显示表面处理后成骨情况；用无水丙酮、无水乙醇、去离子水依次超声清洗。以甘油磷酸钠和乙酸钙配成电解液,低温下行微弧氧化处理。处理参数如下：电压350V,频率800HZ,占空比20%,氧化时间30S,去离子水超声清洗；无菌环境下使用15W UVC灭菌灯,距离材料表面5cm,对微弧氧化纯钛种植体表面照射48h。两组皆在去离子水中储存,γ射线消毒后备用。2.实验动物的选择和分组：实验组为UVC+MAO组,对照组为MAO组。每只兔子随机抽取左侧胫骨植入对照组MAO植体,右侧胫骨植入实验组UVC+MAO植体。将26只新西兰兔随机抽出一只作为一周实验模型,一周后处死,采用同种灭菌处理的实验组(UVC+MAO组)和对照组(MAO组)种植体植入相同位点。随机抽出一只作为四周实验模型,4周后处死,采用同种灭菌处理的实验组(UVC+MAO组)和对照组(MAO组)种植体植入相同位点。剩余的24只兔分为2、4、6周三个组,每组8只,采用同种灭菌处理的实验组(UVC+MAO组)和对照组(MAO组)种植体植入相同位点。3.实验过程：手术过程：实验兔全麻下仰卧位,分别在兔的左右胫骨干骺线近心端制备种植窝,随机抽取兔左腿胫骨植入MAO组种植体,右腿胫骨植入UVC+MAO组种植体,植入位点位于胫骨干骺线偏近心端,富含骨松质,离骨髓腔较远,即种植体处于骨松质范围内,统一了种植体与周围骨质的相对生长环境,方便日后组织学观察比较,种植体植入深度以平齐骨面为准。按时间表开始手术,建立动物模型,术后3天均予以肌注庆大霉素预防感染。4周组、6周组动物于处死前第14、13天颈部皮下注射盐酸四环素(30mg/kg),2周组、4周组、6周组动物于处死前第4、3天颈部皮下注射钙黄绿素(10mg/kg)。按时间表处死实验兔,分离胫骨,获取带种植体的骨标本,经牙科CT扫描植入位点及大体成骨情况后置入10%福尔马林4。C固定1周备用,流水冲洗24h。将标本分割成1.0cm×1.0cm×1.0cm的大小,用乙醇梯度脱水,氯仿透明和甲基丙烯酸甲酯包埋。采用Leica SP1600硬组织切片机切成150-200μm厚的切片,在荧光显微镜下观察荧光效果并测量新骨矿化沉积率(Bone mineralization Apposition Rate,MAR)。然后,手工磨片制作厚度为50-70gm厚的骨磨片,亚甲基蓝-酸性品红染色,用光学显微镜行组织学观察并测量皮质骨区及松质骨区种植体-骨整合长度(BIC%),以及皮质骨区和松质骨区种植体两组骨环腔范围内的新骨面积比(Bone Area,BA%)。结果：1.大体观察实验动物术后生长恢复良好,各组动物均无死亡,伤口无炎症无裂开,每只兔植入两颗种植体,共26只兔,52颗种植体,未发现种植体松动、脱落。切开胫骨近膝关节处的皮肤、肌肉及骨膜后,可见6W组及4W组种植体表面全部被新骨覆盖,2W组见种植体表面略有小部分骨质覆盖或完全暴露,种植区周围骨质可见明显黄染,两组无明显区别。2.荧光显微镜下观察并计算骨矿化沉积率(MAR, μm/d)新生骨质附着荧光而显示绿色(钙黄绿素)和黄色(四环素)。2W组钙黄绿素的绿色荧光明显且呈网状,可明显发现UVC+MAO组贴近种植体骨环腔处有明显的荧光,而MAO组的荧光多距种植体骨环腔有一定的距离。4W组的四环素黄色荧光量明显增多,且与绿色钙黄绿素的荧光交织成网状,两荧光标记之间间距较小。UVC+MAO组显示的荧光量略比MAO组的多。可见MAO+UVC组的荧光基本贴附于种植体骨环腔表面,也有部分荧光由周边骨组织向种植体骨环腔分泌新骨(MAR:4.50±1.80μm/d)。而MAO组的荧光多与种植体表面有一定不规则的距离,大部分荧光来自于周围成熟骨组织向种植体骨环腔分泌新骨(MAR:2.75±0.67μm/d)。根据独立方差计算t值,并对自由度进行校正,检验结果为：t=-4.98,v=36.769,P<0.001；可认为4周实验组与对照组差异有显著意义。6W组显示的荧光比较广泛,黄绿色荧光标记相互交织呈圆环状,也有呈片状、条线状或网状,两荧光标记间距较4周时宽,新骨形成活跃。UVC+MAO组(MAR:6.91±2.36μm/d)发出的荧光总量比MAO组(MAR:4.42±1.21μm/d)的多。此时两组的荧光显示周围骨壁向种植体表面分泌的新骨与紧贴种植体表面生长的新骨连成一片,无明显分界。检验结果为：t=-5.13,v=43.311,P<0.001；可认为6周实验组与对照组差异有显著意义。3.组织学观察并计算种植体-骨整合率(BIC%)及新骨面积比(BA%)用光学显微镜观察亚甲基蓝-酸性品红染色片。种植体植入2周时,新生骨量较少,UVC+MAO组近骨皮质表面的种植体骨环腔中,新生骨量略多于位于松质骨区骨环腔中的成骨量。此时无明显大块成骨,多为不规则骨小梁,且可见紧贴种植体表面略有细长骨小梁生成,同时周围骨组织凸向骨环腔里分泌新骨。而MAO组中骨环腔里大部分为深蓝色成骨细胞、类骨质、纤维组织或肌肉组织,且这些组织离种植体表面有一定距离,部分周围成熟骨组织分泌的新骨凸向骨环腔。两组间皮质骨区的种植体-骨整合率差异有统计学意义(F=7.285,P<0.001),实验组BIC%(48.156±19.058)显著高于对照组(10.452±8.080)。两组间松质骨区的种植体-骨整合率差异有统计学意义(F=5.57,P<0.001),实验组BIC%(31.009±16.714)显著高于对照组(6.815±4.750)。两组间皮质骨区新骨面积百分数(BA%)差异有统计学意义(F=5.415,P<0.001),实验组BA%(42.890±21.061)显著高于对照组(13.355±5.691)。两组间松质骨区新骨面积百分数(BA%)差异有统计学意义(F=5.046,P<0.001),实验组BA%(20.461±11.592)显著高于对照组(5.102±3.723)。种植体植入4周时,UVC+MAO组中新生骨量略多,有部分骨环腔可见周围成熟骨组织凸向骨环腔形成的新骨与种植体表面新骨连成一片。MAO组骨环腔中仍有大部分蓝色类骨质以及少量的新生骨小梁。两组间皮质骨区的种植体-骨整合率差异有统计学意义(F=3.282,P=0.003),实验组BIC%(52.934±20.482)显著高于对照组(31.288±16.622)。两组间松质骨区的种植体-骨整合率差异有统计学意义(F=4.572,P<0.001),实验组BIC%(51.025±20.369)显著高于对照组(25.061±10.059)。两组间皮质骨区新骨面积百分数(BA%)差异有统计学意义(F=3.683,P=0.001),实验组BA%(53.160±21.831)显著高于对照组(29.185±14.194)。两组间松质骨区新骨面积百分数(BA%)差异有统计学意义(F=4.333,P<0.001),实验组BA%(41.931±15.445)显著高于对照组(20.591±12.228)。种植体植入6周时,UVC+MAO组新生骨质多于MAO组。其中皮质骨区新生骨组织充满骨环腔,可见板层骨和哈弗斯管,松质骨区种植体骨环腔成骨略少,新骨不断沉积矿化,骨板连续性较好。MAO组新骨组织改建成板层骨,成骨略少,未完全充满骨环腔。两组间皮质骨区的种植体-骨整合率差异有统计学意义(F=7.067,P<0.001),实验组BIC%(63.011±7.024)显著高于对照组(48.623±4.120)。两组间松质骨区的种植体-骨整合率差异无统计学意义(F=1.978,P=0.057),实验组BIC%(53.648±9.535),对照组(48.030±6.183)。两组间皮质骨区新骨面积百分数(BA%)差异有统计学意义(F=6.336,P<0.001),实验组BA%(71.640±6.605)显著高于对照组(58.237±5.289。)。两组间松质骨区新骨面积百分数(BA%)差异有统计学意义(F=2.866,P=0.008),实验组BA%(64.924±12.915)显著高于对照组(53.396±9.597)。结论：1.带有环形骨腔的种植体能利用骨环处稳定的骨缺损空间,更清晰的比较不同表面处理方法对成骨的影响,其中包括不同时间段的成骨方式及成骨量。2.经过紫外线处理微弧氧化纯钛种植体早期能明显促进种植体-骨整合,皮质骨区种植体-骨整合率是微弧氧化组的4.8倍；松质骨区种植体-骨整合率是微弧氧化组的4.5倍。随着时间推移,紫外线照射的作用效果减弱,两组的骨整合效果差异减小。3.经过紫外线处理的微弧氧化纯钛种植体,早期的成骨方式主要表现为双向成骨(一方面种植体表面吸附成骨细胞生长成新骨,另一方面骨腔周围成熟骨质向骨腔内分泌新骨)。而微弧氧化组的早期成骨方式主要表现为距离成骨(骨腔周围成熟骨质向骨腔内分泌新骨)。2周时,紫外线处理组新骨形成面积己达到43%,而微弧氧化组仅为13%。4.早期皮质骨的成骨速率是松质骨的2倍,随着时间推移,皮质骨区与松质骨区的新骨形成速率差异不明显。5.经过紫外线照射后,主要作用表现为成骨早期增加成骨细胞对种植体表面的黏附从而新生骨质,而对成骨中后期的骨矿化速率无明显的影响。