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禽戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)是鸡大肝大脾病(Big liver and spleen disease,BLS)或肝脾肿大综合征(Hepatitis-Splenomegaly,HS)的主要病原,通常造成30~72周龄的蛋鸡和肉种鸡产蛋率下降以及死淘率升高。马立克病毒(Marek’s Disease virus,MDV)是常见的禽肿瘤病病毒之一,引发鸡的高度接触性恶性淋巴肿瘤性的马立克病(Marek’s Disease),感染鸡群造成鸡的免疫抑制给家禽养殖业造成很大的经济损失。目前国内鸡群感染禽HEV的报道较少,还没有发现蛋鸡群中存在禽HEV。MDV与REV、ALV等双重或多重混合感染的病例报道显示出,MDV与其他病毒的共感染比单独MDV感染造成的危害更大。截至目前没有禽HEV与MDV共感染的报道。本研究从患有大肝大脾病的海兰褐蛋鸡群采集发病鸡25只和表观健康鸡5只。鸡只进行剖检并制备病理组织切片HE染色。剖检发现肝脾肿大,并有肿瘤存在,病理组织学观察发现肝细胞水泡变性普遍,个别小血管周围有数量不多的、大小不一的淋巴细胞聚集,肝窦内出现零星嗜异白细胞,表现出典型MD症状并伴有炎症反应。无菌采集30只鸡的抗凝血,离心取其靠近白细胞层的血浆接种CEF,培养7~9d后,细胞上清用于ELISA试剂盒检测ALV-P27抗原,细胞用于间接免疫荧光试验(IFA)。ELISA试验结果表明,所有样品均为ALV-P27抗原阴性。IFA试验结果表明,用MDV的单抗H19检测到阳性细胞,而用ALV、REV的单抗JE9和11B118未检测到阳性信号。该结果表明培养的细胞中存在MDV野毒。提取接种的CEF DNA和30只鸡肝脏DNA,用特异性的5对引物PCR扩增检测MDV、ALV、REV。PCR扩增试验结果显示,MDV阳性率为46.7%(14/30),而ALV、REV全部为阴性。对部分MDV阳性样品进行克隆测序并分析所得序列。结果表明MDV分离株meq基因序列与经典的MDV参考株的同源性为98.7%~100%。分析碱基序列发现MDV分离株为强毒株特征,其575-577位点的碱基为CAC;在meq基因的多脯氨酸功能区EELCAQLCSTPPPPI重复序列中没有脯氨酸(P)的缺失。综合分析结果可以判定分离株来源于野毒。提取送检鸡肝脏样品RNA,反转录为cDNA,通过套式PCR方法扩增禽HEV ORF2部分基因序列并对阳性样品进行克隆测序,根据得到的禽HEV ORF2部分基因序列,比较其与国内外参考株的同源性以及确定基因型。RT-PCR检测结果显示,发病鸡肝脏样品中禽HEV检出率为56%(14/25),表观健康鸡禽HEV检出率为80%(4/5)。测序结果显示样品禽HEV ORF2基因片段与国内外经典参考株的同源性为77.3%~98.3%,属于禽HEV基因3型。取禽HEV RNA阳性鸡的肝脏与PBS缓冲液混合研磨并过滤,肝脏悬液作为病毒,翅静脉注射到4只两周龄SPF鸡,对照组SPF鸡注射生理盐水。饲养至14天采集肝脏,提取RNA并反转录,进行HEV RNA的鉴定,对阳性结果克隆测序以确定病毒来源。采集的肝脏样品,套式PCR方法检测到攻毒组有250bp大小的目的条带,所得序列与攻毒肝脏悬液序列同源性为100%,而对照组未检测到禽HEV RNA。该检测结果表明,用于攻毒的脏悬液中禽HEV具有完整的生物活性可以再次传染给鸡。为了解禽HEV在肿瘤病发病的种鸡场中的感染率,对七个肿瘤病发病的种鸡场,进行禽HEV病原学调查。从该禽HEV阳性海兰褐蛋鸡的父母代种鸡群采集粪便40份和抗凝血20份,另外从其他6个发生肿瘤病的种鸡场采集粪便和鸡只等样品,共165份样品。提取样品RNA,反转录后进行禽HEV的套式PCR检测。结果显示,来自该海兰褐父母代种鸡群的粪便样品中禽HEV检出率为67.5%(27/40),血浆样品中禽HEV检出率为20%(4/20),而从其他6个种鸡场采集的样品中没有检测到禽HEV。随机挑选两个样品克隆测序。序列比对结果显示,与分离自该海兰褐蛋鸡的3个禽HEV序列同源性为98.3%~100%,进化树分析显示在同属于基因3型,并在同一分支。为调查市场活禽和野生鸟类禽HEV感染的状态,给禽HEV的防控和野生鸟类疾病监测提供数据参考。东亚-澳大利亚迁徙路线经过我国南北两点:黄河三角洲自然保护区和江苏盐城湿地珍禽自然保护区。2014年~2016年共采集野生鸟类和活禽市场粪便样品2691份,提取RNA并反转录后,荧光定量PCR方法检测禽HEV RNA。结果显示,未检测到阳性样品,可疑样品7份。通过套式PCR将可疑样品进行验证,结果发现全部没有扩增出目的条带。本次调查未发现采集的野生鸟类和市场活禽样品中存在禽HEV。