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地枫皮是木兰科八角属植物,生长在喀斯特地形的丘陵中,是国家Ⅲ级重点保护野生植物,其干燥的茎皮为广西特色药材,具有治疗跌打损伤、风湿骨痛的疗效。因其生境的破坏和人为的过度挖掘,导致地枫皮野生种群减少,综合利用率下降。地枫皮内生真菌的分离纯化国内外未见报道,本文首次对地枫皮内生真菌的分离纯化及其抑菌活性物质进行了报道。本文以地枫皮为研究对象,对其根、茎、叶中的内生真菌进行分离纯化,采用形态学和分子生物学手段对活性菌株进行鉴定。选取其中4株为研究对象,采用固体培养基进行扩大发酵培养,有机溶剂浸提获取发酵粗提物。以8种植物病原真菌和13种动物病原菌为供试菌,采用菌丝生长速率法和带毒平板法测定了粗提物的抑菌活性。采用硅胶柱色谱、薄层色谱、溶剂重结晶、高效液相色谱等分离技术并结合活性追踪对抑菌活性成分进行分离纯化,采用核磁共振谱对单体化合物进行结构鉴定。同时对其中2株内生真菌的生物学特性进行了研究。研究结果如下:采用组织培养法从广西特色壮药地枫皮的根、茎、叶中共分离得到30株内生真菌,通过平板对峙法对8种植物病原真菌进行抑菌活性检测,发现DFP-G-5、DFP-G-7、DFP-G-9、DFP-P-7.1有较强的抑菌活性。采用形态学和分子生物学手段对菌株DFP-G-5、DFP-G-7、DFP-G-9和DFP-P-7.1进行鉴定,结果表明,DFP-G-5为毛壳属真菌球毛壳菌Chaetomium globosum,DFP-G-7为镰孢属真菌Fusarium nematophilum,DFP-G-9为柱孢属真菌Cylindrocarpon olidum,DFP-P 7.1还未确定其种属关系。对4株内生真菌应用大米固体发酵培养基进行扩大培养,应用乙酸乙酯浸提发酵物获得4株内生真菌发酵产物的乙酸乙酯提取物。以8种植物病原真菌和13种动物病原菌为供试菌,测定4株内生真菌发酵产物的乙酸乙酯粗提物的抑菌活性。结果表明,当提取物浓度为5g/L时,4株地枫皮内生真菌发酵产物的乙酸乙酯提取物对8株植物病原真菌均有抑制活性,DFP-G-7发酵产物的乙酸乙酯提取物对茶轮斑病菌、水稻胡麻叶斑病菌、甘蔗凤梨病菌、烟草黑胫病菌的菌丝生长的抑制活性高,抑菌率达到100%,对其余4种植物病原真菌的抑制活性较高,抑菌率为67.07%86.80%。DFP-G-9发酵产物的乙酸乙酯提取物对甘蓝黑斑病菌、水稻胡麻叶斑病菌、玉米大斑病菌、甘蔗凤梨病菌、烟草黑胫病菌在浓度为5g/L时的抑制活性高,抑菌率达到100%,对贡柑链格孢菌的抑制活性一般,抑菌率为67.65%,对辣椒炭疽病菌和茶轮斑病菌的抑制效果较差,抑菌率分别为47.33%和29.16%。DFP-G-5发酵产物的乙酸乙酯提取物在浓度为5g/L时对水稻胡麻叶斑病菌、玉米大斑病菌、贡柑链格孢菌、辣椒炭疽病菌和烟草黑胫病菌的抑制活性高,抑菌率达到100%,对于其他3种植物病原真菌的抑制活性也较高,抑菌率为84.56%95.13%。DFP-P-7.1发酵产物的乙酸乙酯提取物对烟草黑胫病菌、甘蓝黑斑病菌、水稻胡麻叶斑病菌、玉米大斑病菌、贡柑链格孢菌和甘蔗凤梨病菌的抑制活性高,抑菌率均为97.62%100%,对茶轮斑病菌和辣椒炭疽病菌的抑制活性较差,抑菌率为30.19%和44.99%。进一步测定了4株内生真菌的乙酸乙酯提取物对8种植物病原真菌的菌丝生长的毒力,DFP-G-5发酵产物的乙酸乙酯提取物对甘蔗凤梨病菌的毒力最高,EC50为0.0095g/L,对贡柑链格孢菌的毒力最低,EC50为0.8927g/L,对其余6种植物病原真菌的EC50为0.1644g/L0.5191g/L。DFP-G-7发酵产物的乙酸乙酯提取物对5种植物病原真菌菌丝的EC50为0.0015g/L2.0005g/L。DFP-G-9发酵产物的乙酸乙酯提取物对5种植物病原真菌菌丝的EC50为0.0026g/L0.1292g/L。DFP-P-7.1发酵产物的乙酸乙酯提取物对6种植物病原真菌菌丝的EC50为0.02170.7884g/L。采用带毒平板法测定4株内生真菌的发酵产物的乙酸乙酯提取物对13种动物病原菌的抑制活性,结果表明,DFP-G-7发酵产物的乙酸乙酯提取物对普通变形杆菌、炭疽杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、藤黄微球菌和乙型副伤寒杆菌的抑制活性较高,MIC为0.3125g/L0.625g/L,对白色念珠菌、产气肠杆菌、巨大芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和铜绿假单胞菌的抑制活性较低,MIC为1.25g/L2.5g/L。DFP-G-9发酵产物的乙酸乙酯提取物对大肠杆菌、藤黄微球菌、蜡状芽孢杆、乙型副伤寒杆菌、炭疽杆菌、溶壁微球菌和巨大芽孢杆菌的抑制活性较高,MIC为0.039g/L0.156g/L,对白色念珠菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌和铜绿假单胞菌的抑制活性较差,MIC为0.313g/L1.25g/L,对产气肠杆菌的抑制活性最差,MIC为5g/L。DFP-G-5发酵产物的乙酸乙酯提取物浓度为2.5g/L时,对铜绿假单菌和产气肠杆菌无抑制活性,对其余11种动物病原菌有抑制活性,对巨大芽孢杆菌、大肠杆菌和普通变形杆菌的抑制活性最好,MIC为0.0098g/L,对溶壁微球菌、白色念珠菌、炭疽杆菌的抑制活性较好,MIC为0.0195g/L,对蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌和乙型副伤寒杆菌的抑制活性较低,MIC为0.0391g/L0.1563g/L。DFP-P-7.1发酵产物的乙酸乙酯提取物浓度为2.5g/L时,对12种动物病原菌有72 h的抑制活性,对产气肠杆菌无抑制活性。DFP-P-7.1发酵产物的乙酸乙酯提取物对炭疽杆菌、白色念珠菌、巨大芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、藤黄微球菌、溶壁微球菌、乙型副伤寒杆菌和大肠杆菌8种动物病原菌的抑制活性最好,MIC均为0.313g/L,对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌2种革兰氏阳性细菌的抑制活性较好,MIC为1.25g/L,对普通变形杆菌和铜绿假单胞菌2种革兰氏阴性细菌的抑制活性较差,MIC为2.5g/L,对产气肠杆菌的抑制活性最差,MIC为5g/L。DFP-G-9发酵产物的乙酸乙酯提取物经硅胶柱层析、薄层层析以及溶剂重结晶等技术进行抑菌活性单体化合物的分离纯化,从中共分离得到化合物2个,分别命名为:DFP-9b和DFP-9c,2个化合物在质量浓度为0.1mg/mLl时对甘蔗凤梨病菌的抑菌率分别为97.14%和96.17%。DFP-9b和DFP-9c通过核磁共振谱分别鉴定为7-chloro-1-O-methylemodin和7-chloroemodin。对菌株DFP-G-7和DFP-G-9的生物学特性进行研究,以2株内生真菌的菌落生长直径大小为评价指标,测定了DFP-G-7和DFP-G-9在不同碳源、不同氮源、不同温度、不同pH值下菌落的生长情况。结果表明,DFP-G-7的最适碳源为甘露醇、最适氮源为硝酸钙、最适温度为25℃、最适pH值为7。DFP-G-9的最适碳源为可溶性淀粉、最适氮源为硫酸铵、最适温度为25℃,最适pH值为7。