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佩梅样病(Pelizaeus-Merzbacher-like disease,PMLD,OMIM 608804)是一种婴幼儿期起病的常染色体隐性遗传白质脑病,其发病率国内外尚无统计报道,男女发病率无明显差异。2004年,Uhlenberg等人将其致病基因定位于1q41-42的缝隙连接蛋白C2(gap junction protein gamma-2,GJC2,GenBank NM-020435),又称GJA12(gap junction protein alpha 12,GenBank AAB94511),编码缝隙连接蛋白47(gap junction protein connexin47,Cx47),Cx47蛋白表达于少突胶质细胞,与星形胶质细胞表达的Cx43蛋白形成Cx47/Cx43异型耦联通道。少突胶质细胞和星形胶质细胞通过此通道来维持细胞之间的信号传递及细胞间和细胞内的离子平衡,对于中枢神经系统的髓鞘形成和维护具有重要作用。目前PMLD的致病机制尚不明确,既往研究发现,不同突变体的致病机制不同,并提出了三方面机制:⑴突变的GJC2不能形成Cx47;⑵突变的GJC2形成的Cx47在内质网大量聚集,不能被运送至细胞膜,影响与Cx43形成耦联;⑶异常的Cx47与Cx43能形成耦联但功能异常。目的本研究是为了揭示从中国PMLD患者中发现的5种GJC2突变对Cx47蛋白亚细胞定位改变的影响:GJC2突变后导致其编码的Cx47聚集于内质网,影响其正常的膜上转运,无法与Cx43形成正常耦联通道,破坏了少突胶质细胞的功能,导致少突胶质细胞凋亡,从而揭示该5种GJC2突变类型的致病机制。同时,为PMLD未来的治疗提供理论依据和实验基础。方法在pEGFP-N1-GJC2野生型质粒的基础上,通过定点突变的方法,构建在PMLD患者中检出的5种未报道的GJC2突变的突变体质粒:GJC2 c.201C>G(p.C67W)、c.216delGinsAA(p.P73fs X106)、c.217C>T(p.P73S)、c.735C>A(p.C245X)、c.973G>C(p.A325P)。用Lipofectamine 2000试剂盒脂质体介导的化学方法转染人类少突胶质细胞系MO3.13,建立GJC2的突变型和野生型模型,并用ER-tracker将细胞内质网标记为红色荧光,用DAPI将细胞核标记为蓝色荧光,应用激光共聚焦显微镜技术观察野生型Cx47蛋白和突变型Cx47蛋白的亚细胞定位。结果成功构建了5种突变型pEGFP-N1-GJC2质粒;通过激光共聚焦显微镜技术观察发现,野生型Cx47蛋白大部分分布在少突胶质细胞的细胞膜上,仅少部分贮积于内质网中,约5.2%;而突变型Cx47蛋白却大部分贮积在内质网中,不同Cx47突变体在内质网中的贮积程度不同,C67W、P73fsX106、P73S、C245X、A325P的贮积率分别为91.4%、81.4%、87.1%、88.3%、89.7%。结论5种GJC2突变均为致病性突变,均使其编码的Cx47蛋白不同程度的贮积在内质网中,而无法正常转运至细胞膜,改变了Cx47的亚细胞定位,影响少突胶质细胞和星形胶质细胞之间形成Cx47/Cx43正常耦联通道,破坏了少突胶质细胞的功能,遏制了正常中枢神经系统髓鞘的形成,证实了既往提出的致病机制;不同类型突变的Cx47内质网贮积率未见明显差异;大量异常的Cx47蛋白贮积于内质网中,可能引发内质网应激,激活未折叠蛋白反应,导致少突胶质细胞凋亡,需进一步实验证实。