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目的:FGF2和FGFR1与多种肿瘤的发生发展关系密切。FGFR1是肺鳞癌重要驱动基因之一,大约20%的肺鳞癌患者存在FGFR1基因扩增,拮抗FGFR1成为肺鳞癌治疗的重要靶点。FGFR1胞外段可通过与细胞膜上受体竞争配体来调节FGFs与FGFR1的相互作用。因此,本课题构建了FGFR1胞外D1-D2-D3段加载免疫球蛋白IgG恒定区Fc段的融合蛋白,在药物设计方面,研究了蛋白质的合成,阳性NS/0细胞的筛选,无血清驯化以及目的蛋白的分离纯化等方法。在体外,从抑制细胞生长,周期进程,新生血管生成,细胞侵袭与迁移,细胞内信号分子活化,以及干扰FGFR1表达几个方面解析了FGFR1-Fc融合蛋白抗肺鳞癌的作用机制。 方法: 1.FGFR1-Fc融合蛋白的合成,表达,纯化以及亲和性的研究 将编码了人FGFR1胞外序列和人IgG1 Fc片段的重组质粒以电转化法转化入NS/0杂交瘤细胞中,利用选择性培养基筛选阳性细胞,克隆出可以表达FGFR1-Fc融合蛋白的细胞株。之后采用降低培养基血清浓度的方法驯化NS/0细胞,ProteinA柱层析法分离纯化目的蛋白,ELISA方法检测FGFR1-Fc与FGFs的亲和力。 2.FGFR1-Fc融合蛋白的抗肺鳞癌机制的研究 首先利用Western blotting,PCR验证不同肺鳞癌细胞系中FGF2与FGFR1之间的关系。之后利用MTT法检测FGFR1-Fc融合蛋白对FGFR1高表达肺鳞癌细胞株的增殖作用;流式细胞术分析FGFR1-Fc对细胞周期调控的作用;Transwell方法分析药物对肿瘤细胞侵袭转移能力的影响;CAM模型分析FGFR1-Fc对新生血管生成的作用;Western blotting解析药物对FGF2/FGFR1信号通路相关蛋白质磷酸化水平的影响;最后,通过干扰FGFR1表达反向验证FGFR1-Fc抗肺鳞癌的作用靶点。 结果: 1.FGFR1-Fc融合蛋白的合成,表达,纯化以及亲和性的研究 pN24/FGFR1-Fc质粒可以合成谷氨酰胺合成酶,因此利用不含谷氨酰胺的培养基筛选出成功转染质粒的的NS/0杂交瘤细胞,之后通过逐步降低血清含量来驯化细胞,最终得到能够在不含血清的选择性培养基中稳定生长传代并表达蛋白的NS/0细胞株。利用Protein A亲和层析柱分离可从1L培养基上清中得到含量高达400mg的目的蛋白,纯度为95%。体外的ELISA结果证明FGFR1-Fc与FGF-2具有高亲和性。 2.FGFR1-Fc融合蛋白的抗肺鳞癌机制的研究 FGFR1-Fc可有效拮抗FGFR1高表达肺鳞癌细胞系的增殖,使大量细胞阻滞在G0/G1期,且可有效抑制肺鳞癌细胞的侵袭转移能力。鸡胚绒毛尿囊膜实验中,发现FGFR1-Fc明显抑制新生血管生成,抑制效果与计量成正比。除此之外,FGFR1-Fc可有效下调FGF2/FGFR1信号通路中相关蛋白的活化。最后小分子RNA干扰实验可知FGFR1-Fc对FGFR1干扰细胞无作用。 结论: 本实验完成了FGFR1-Fc融合蛋白高效表达工程细胞株的构建和筛选;建立了高效表达的培养和纯化工艺。本课题通过体内外试验,确证了FGFR1-Fc融合蛋白通过对FGF-2/FGFR1相互作用的调控,实现了对FGFR1过表达肺鳞癌细胞系的靶向治疗作用。由此可见FGFR1-Fc融合蛋白,具有很好的研发前景。